Nat Chemistry | 刘晓刚等开发多色“点亮型”荧光多肽，实现免洗成像与PD-1药物筛选

荧光成像能够以高时空分辨率追踪活细胞中的分子事件。多肽探针兼具结构可编程性和靶标选择性，是化学生物学中重要的成像工具；然而，常规荧光标记通常需要洗涤去除未结合探针，或者依赖较长孵育时间来获得足够的信噪比。荧光氨基酸（fluorogenic amino acids,FgAAs）为解决这一问题提供了思路：如果能够让荧光团在游离状态保持“暗”，在进入特定微环境或结合靶标后再“点亮”，就有望直接实现免洗成像。

2026年8月26日，英国爱丁堡大学Marc Vendrell、Lorena Mendive-Tapia团队与新加坡南洋理工大学刘晓刚团队等合作在Nature Chemistry在线发表题为A general strategy towards multicolour fluorogenic peptides for wash-free bioassays的研究论文。 研究提出了一种模块化设计策略：以色氨酸作为通用的分子内猝灭器，将多种成熟高亮度荧光团转化为从紫外到近红外覆盖的FgAA，随后将这些构件直接嵌入多肽，实现免洗成像并进一步拓展到PD-1相关药物筛选。

把色氨酸变成“内置荧光开关”

研究团队将Fmoc保护的Trp与多类碘代荧光团通过Pd催化C–H活化直接形成C–C键，构建结构紧凑的FgAA。该路线覆盖coumarin、BODIPY、HPF、O-rhodamine、oxazone和Si-rhodamine等多种荧光骨架，发射范围从可见光延伸至近红外。与对应母体荧光团相比，Trp连接后多数FgAA的荧光量子产率大幅下降，而主要吸收/发射位置和高消光系数仍能较好保留，从而实现“游离态关闭、结合或环境变化后开启”的荧光响应。

计算化学揭示两条通用的猝灭路径

为什么同一个Trp能够让结构差异很大的荧光团都进入暗态？研究团队利用DFT/TD-DFT对这一问题进行了系统解析。结果表明，Trp诱导的猝灭主要通过两条路径实现：光诱导电子转移（PeT）和扭转分子内电荷转移（TICT）。当Trp与荧光骨架在电子结构上相对隔离时，Trp可提供与荧光团前线轨道能量接近的供电子轨道，激发后形成非发光的电子转移态；当Trp与荧光骨架发生更明显的共轭耦合时，体系则更容易通过构象扭转进入TICT暗态。这一分析把不同荧光团的“经验式调参”进一步归纳为可解释的机理规则，也解释了环境极性和构象限制为何能够控制荧光开启。

从多色免洗成像走向活细胞应用

六种FgAA在水中均保持较低荧光，而在更黏稠、较疏水的甘油环境中出现约8–40倍的荧光增强，与PeT/TICT暗态受到环境调控的计算结果一致。研究团队随后将三种不同颜色的FgAA引入膜结合多肽。在E. coli中，这些探针仅需孵育数分钟即可清晰标记细胞包膜，无需洗涤，三种代表性多肽的成像信噪比分别达到18、33和57。类似的免洗标记也可用于人中性粒细胞，说明这一策略可以适配不同细胞类型和成像波段。

近红外FgAA用于识别PD-1阳性活化T细胞

在此基础上，作者进一步将平台推进到免疫检查点PD-1的活细胞分析。通过优化Si-rhodamine FgAA的甲基化模式和Trp连接位置，团队获得了兼具近红外发射、高消光系数和固相多肽合成兼容性的化合物28，并将其引入多种线性和环状PD-1结合肽。其中，肽36对PD-1阳性的活化人T细胞表现出最佳区分能力，在含血清培养体系中仍可进行免洗成像。表面等离子体共振实验测得肽36与人PD-1的KD为14 μ M；PD-L1竞争实验进一步支持其靶向结合。

把“点亮型”探针变成药物筛选读出

研究团队进一步利用肽36对活化T细胞表面PD-1水平进行流式荧光定量，并筛选了9种免疫相关小分子。多数化合物对PD-1表达影响有限，而avasimibe呈现清晰的剂量依赖性降低效应。进一步的ELISA结果显示，avasimibe还可降低活化T细胞释放的TNF，支持其免疫调节作用。论文指出，此前尚未报道avasimibe对活化人T细胞PD-1表达的这一调控现象。

总体来看，这项工作建立了一条“亮荧光团 → Trp分子内猝灭 → FgAA → 荧光多肽 → 免洗活细胞分析”的模块化路线。其价值不仅在于获得了一组从可见光到近红外的多色荧光构件，更在于通过计算化学将不同骨架的猝灭行为归纳为PeT/TICT两类可解释的设计机制，从而为后续扩展到更多荧光团、靶标和生物分析场景提供了通用思路。与此同时，部分骨架在固相多肽合成条件下的稳定性仍需进一步优化；avasimibe对PD-1表达的调控也仍需要更深入的分子机制研究。

论文共同第一作者为Man Sing Wong、Lorena Mendive-Tapia、Utsa Karmakar和Lovelesh Vashist；通讯作者为Lorena Mendive-Tapia、刘晓刚和Marc Vendrell。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-026-02228-0

制版人： 十一

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