《食品科学》：江苏省农业科学院张辉研究员等：内化素InlJ对噬菌体抗胞内单核细胞增生李斯特菌感染的影响

李斯特菌属（Listeria spp.）是一类能够引起动物和人李斯特菌病的革兰氏阳性菌（G+），其中单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是目前最重要的食源性人兽共患胞内致病菌，可引起胃肠炎、流产和脑膜炎等。Lm广泛分布于自然界中，如土壤、污水、植物和食品等，耐低温、低pH值和高渗透压等极端环境。研究显示，Lm在牛奶、生肉、蔬菜、海鲜等食品原料中均能长期存活。美国FoodNet数据显示，2023年Lm引发全美食物中毒事件约160 起，病死率高达22.5%。Lm具有独特的侵袭和内化特性，从而使其穿越肠道、血脑和胎盘屏障。而这一特性主要由其特定的内化素因子调控，内化素能够影响Lm的黏附和侵袭能力，从而影响Lm的感染及致病性。

Lm的致病基因主要分布在LIP1毒力岛和内化素岛，内化素岛上含有一个多基因家族，其中InlA和InlB是Lm侵袭过程中最重要的表面内化蛋白。InlA能与宿主细胞的特异性受体结合，进而介导Lm进入细胞，并借助InlB内化途径共同作用，以激活宿主细胞膜的内吞机制。研究表明，内化素InlJ与InlA均在C-末端含有LPXTG基序，N-末端携带LRR结构域，这类结构域可被分选酶SortA识别，并通过共价结合方式连接至细胞壁肽聚糖介导其内化侵袭途径。内化素InlJ是Lm中新发现的LPXTG表面蛋白，在胞内感染Lm后特异性产生并锚定在细菌表面。InlJ的LRR结构域为21 个氨基酸且含保守半胱氨酸形成“半胱氨酸梯子”，显著区别于InlA/B，该结构增强LRR结构域折叠稳定性，可能影响配体识别特异性。作为LPXTG的新成员，内化素InlJ的内化机制报道鲜少，其核心功能包括体内特异性表达、黏附与侵袭增强、生物被膜调控及噬菌体互作，与InlA/InlB的经典入侵途径形成互补，如Sabet等亦发现缺失inlJ基因的Lm毒力显著降低，表明内化素InlJ在胞内感染中发挥重要作用。

噬菌体是一种能够专性感染细菌的病毒，其不仅能有效裂解宿主菌，且在对抗胞内菌感染中具有独特的优势，如Carrigy等通过小鼠鼻吸入噬菌体D29，在24 h内显著降低感染鼠的结核分枝杆菌载量。此外，Zhao Min等通过CRISPR-Cas9技术编辑的工程噬菌体selzHA-TAT可高效穿透哺乳动物上皮细胞并清除胞内感染的沙门菌，为临床治疗胞内菌感染提供了全新的技术方案。内化素InlJ作为Lm细胞壁表面蛋白重要成员，参与噬菌体与宿主间相互作用。为进一步解析内化素InlJ对胞内感染中的关键作用，扬州大学食品科学与工程学院的刘景新和江苏省农业科学院的柏梅、张辉*等通过inlJ基因的缺失及回补，对其在Lm感染细胞中的黏附、侵袭和胞内增殖以及线粒体损伤中的作用进行分析，其次，通过缺失株与噬菌体的敏感性分析，进一步明确噬菌体在抗胞内菌感染中的作用靶点，明确内化素在Lm与噬菌体相互作用中的关键调节作用，以期进一步阐明inlJ基因在噬菌体与Lm相互作用中的调节功能。

1

重组质粒pIMK2-inlJ的鉴定

通过引物对P1/P2扩增获得inlJ基因片段，如图1所示，扩增获得约2 500 bp产物与目的基因大小相符，测序鉴定表明与inlJ基因2 905 bp一致，缺失株对照中未扩增出inlJ全基因，仅为332 bp的同源臂序列。将扩增产物纯化后与质粒pIMK2连接，转化后鉴定挑取的阳性克隆，测序结果表明pIMK2-inlJ重组质粒构建正确。

2

Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ构建、筛选与鉴定

将重组质粒pIMK2-inlJ电穿孔转化至Lm NJ05-ΔinlJ感受态细胞中，并涂布至含有卡那霉素的BHI平板，30 ℃培养48 h。挑取单克隆，接种至BHI液体培养基中，42 ℃、180 r/min培养，进行PCR鉴定，如图2所示，阳性转化子中可扩增出同源重组回补的内化素基因inlJ编码序列，且测序分析正确与预期相符。

3

Lm NJ05-ΔinlJ及NJ05-ΔinlJ::inlJ对噬菌体的敏感性分析

EOP分析表明Lm缺失株NJ05-ΔinlJ与噬菌体作用后成斑效率明显升高，为野生型Lm NJ05的1.37 倍（表3）。由此可见，inlJ基因的缺失能够使Lm对噬菌体的敏感性增强，参与噬菌体与Lm间的相互作用。

4

体外噬菌体裂解曲线

由图3可知，噬菌体vB-LmoM-SH3-3对Lm缺失株NJ05-ΔinlJ的敏感性明显高于野生型NJ05，裂解显著上升。与Lm NJ05及回补株相比，在作用1 h后，Lm NJ05-ΔinlJ OD600值由0.47降至0.21，作用至5 h，OD600 nm值为0.01，且培养物澄清，裂解效果显著。由此可见，inlJ基因的缺失可影响Lm与噬菌体相互作用，增强其对噬菌体vB-LmoM-SH3-3的裂解活性。

5

黏附性与侵袭性

通过感染Caco-2细胞分析inlJ基因缺失后的Lm对细胞黏附和侵袭活性的影响，明确内化素InlJ在细胞感染内化中的作用。由图4可知，相比Lm NJ05，缺失株Lm NJ05-ΔinlJ黏附力显著下降，与Lm NJ05相比，对细胞的黏附力降低了56.37%。通过噬菌体预处理细胞后，Lm NJ05、Lm NJ05-ΔinlJ和Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ对Caco-2细胞的黏附均有所下降。由此可见，噬菌体可抑制Lm对细胞的黏附能力。细胞侵袭性结果表明，相比Lm NJ05，缺失株Lm NJ05-ΔinlJ对Caco-2细胞的侵袭力降低17.74% （图5），表明缺失inlJ基因的Lm侵袭力减弱。噬菌体预处理后，Lm NJ05、Lm NJ05-ΔinlJ和Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ对Caco-2细胞的侵袭力分别为0.41%、0.35%、0.39%，即噬菌体能有效抑制Lm对细胞的侵袭。综上所述，inlJ基因的缺失使Lm对细胞的黏附和侵袭力均降低，而噬菌体预处理细胞后，Lm NJ05及回补株对细胞的黏附和侵袭能力显著减弱。

6

胞内增殖活性

将inlJ基因缺失株作用细胞后，分析其在胞内的增殖情况。结果表明（图6），Lm在作用10 h后，增殖量达到稳定期。缺失株在胞内增殖能力较Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ有所下降，表明inlJ基因参与Lm在细胞内的增殖过程。噬菌体预处理细胞后，Lm在胞内的增殖能力下降，与野生型NJ05比较，缺失株NJ05-ΔinlJ的胞内增殖效率降低47.60%，表明噬菌体亦能够有效抑制Lm在胞内的增殖能力，且对缺失株的抑制力较强。

7

噬菌体有效缓解细胞线粒体损伤

Lm感染细胞后可能参与细胞有丝分裂，内化素InlJ是Lm重要的内化素成员，在感染的不同阶段发挥着重要的作用。对侵袭后的细胞进行Mito-Tracker Red CMXRos染色，野生株Lm NJ05可使Caco-2细胞线粒体膜电位降低，而inlJ基因缺失株作用细胞后，其线粒体膜电位的荧光强度并无显著变化，表明inlJ基因参与细胞线粒体损伤（图7）。与此同时，ROS的聚积可加剧线粒体损伤，而inlJ基因的缺失可减少线粒体ROS的积累，从而降低细胞损伤（图8）。通过噬菌体预处理细胞后，Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ作用细胞后的线粒体膜电位平均荧光强度相较于对照组分别下降了19.07%、21.71%，对细胞线粒体的损伤明显减弱。同样，Lm NJ05、Lm NJ05-ΔinlJ以及Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ感染噬菌体预处理的细胞中的ROS相比感染前分别下降了33.47%、20.15%、22.33%。由此可见，内化素InlJ是线粒体损伤重要因子之一，而噬菌体预处理细胞后，可在胞内有效抑制Lm对线粒体的损伤，从而缓解Lm对细胞的损伤。

8

细胞线粒体DNA表达水平

为进一步明确inlJ基因是否参与线粒体损伤，利用线粒体DNA与核DNA比值分析不同Lm感染细胞的线粒体损伤情况。如图9所示，与细胞对照组相比，Lm NJ05、Lm NJ05-ΔinlJ和Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ作用细胞后，线粒体DNA表达水平分别降低约27.34%、15.67%、26.75%。缺失株Lm NJ05-ΔinlJ感染细胞后其线粒体DNA水平分别较NJ05及回补株升高12.95%和15.84%，即内化素InlJ缺失降低了Lm对细胞线粒体的损伤。当噬菌体预处理细胞后，Lm NJ05、Lm NJ05-ΔinlJ和Lm NJ05-ΔinlJ::inlJ作用后的细胞线粒体表达量均较未处理组显著升高。由此可见，内化素InlJ在Lm感染内化细胞后诱导线粒体损伤中发挥重要作用，而利用噬菌体可以降低细胞线粒体的损伤率。

9

Lm内化素InlJ是近期发现的LPXTG蛋白家族新成员，其结构与经典的内化素InlA相似。研究表明，inlJ基因缺失的Lm对小鼠脑微血管内皮细胞感染及毒力均下降。前期研究表明，inlJ基因缺失株NJ05-ΔinlJ对巨噬细胞RAW264.7的侵袭及黏附力均降低，同样，在对非吞噬细胞Caco-2作用后，缺失株的黏附、侵袭以及胞内增殖也显著下降。由此可见，内化素InlJ与InlA可能具有相似功能，是Lm的细胞感染及侵袭内化中的重要内化蛋白。

线粒体作为细胞的重要细胞器，不仅是合成ATP的主要场所，还在推动细胞能量转化及调控细胞凋亡过程中发挥着重要作用。线粒体膜电位是线粒体进入氧化磷酸化及合成ATP的必要前提，其稳定性对于保障细胞生理功能的正常运行具有重要意义。研究表明，线粒体膜电位下降与自噬、凋亡和坏死有关。Stavru等利用Lm感染细胞后，其线粒体膜电位和细胞内ATP水平均降低。线粒体也是细胞内ROS产生的主要场所，ROS在细胞信号传导和代谢中发挥重要作用，但过量的ROS会导致线粒体损伤和细胞凋亡。本研究表明inlJ基因缺失株对细胞线粒体膜电位无显著影响，ROS聚积水平低于NJ05，即内化素InlJ参与Lm感染侵袭并诱导线粒体损伤过程。然而，噬菌体与细胞的预先作用后，可以有效缓解Lm感染侵袭以及对线粒体的损伤，表明噬菌体良好的抗胞内菌感染的潜力。

目前抗生素仍为临床李斯特菌病的有效治疗手段，然而抗生素的过量使用，导致细菌耐药性的出现，如Poyart-Salmeron等从脑膜炎患者中分离出对氯霉素、链霉素和四环素具有耐药性的Lm。由于抗菌药物无法高效渗透并突破血脑、胎盘等屏障，从而很难有效清除具有胞内感染特性病原菌，最终引发慢性和亚临床感染性疾病，给动物及人类健康带来安全隐患。而噬菌体可以突破膜屏障特异性靶向胞内菌，其作用原理与抗生素完全不同，其通过精准的受体识别和独特的作用模式，能高效靶向裂解宿主菌，尤其是针对难清除的胞内菌。目前噬菌体在食品及医药领域的抗菌研究已受到广泛关注， 如在奶酪、牛奶、水产品等的食品保鲜，以及在肠道疾病的临床治疗等。在本研究中，inlJ基因缺失的Lm与噬菌体作用敏感性显著增强，EOP为野生型的1.37 倍，在体外的有效裂解时间缩短，抑制效率显著升高，表明内化素的缺失可能间接增强噬菌体对Lm的识别效率。在先前研究中发现，T4噬菌体预处理的T84细胞（结直肠癌上皮细胞系）及A549细胞（肺腺癌上皮细胞系）与大肠杆菌的黏附能力显著下降，对细胞毒性降低，抑制率为78.58%。在本研究中利用噬菌体作用Caco-2细胞后，不仅有效抑制Lm对细胞的黏附及侵袭，同时显著影响其在胞内的增殖能力，从而使细胞线粒体损伤显著减弱。由此可见，噬菌体能够有效抑制胞内Lm的感染，而InlJ的缺失使抑制效果显著提升。本研究主要以肠道细胞Caco-2作为模型进行了系统分析，未通过其他类型靶细胞分析该作用特性的普遍性，后续会通过其他细胞如THP-1、HT-29细胞进一步明确其功能的普适性。此外，不同细胞表面蛋白、胞内微环境仍存在差异，可能影响噬菌体的抗菌效果及InlJ的调控作用。目前鲜有研究表明InlJ在噬菌体识别中的作用特性，其对噬菌体敏感性的调控以间接屏障效应为主，通过影响细胞壁表面可及性与生物被膜结构实现；同时InlJ通过分选酶介导的细胞壁锚定，参与调控细胞壁的机械特性与表面理化性质，为Lm适应肠道环境与抵抗宿主免疫提供结构基础。综上所述，内化素InlJ参与调控Lm损伤细胞线粒体及与噬菌体的相互作用，这为Lm噬菌体产品的开发和精准胞内抗感染应用提供了有效的参考依据。

结论

缺失inlJ基因使Lm对细胞的黏附、侵袭和增殖能力均降低，同时在感染细胞后线粒体ROS聚积减少且不影响膜电位，表明InlJ在细胞感染及内化中发挥重要作用。缺失inlJ基因的Lm与噬菌体作用后敏感性增强，表明内化素InlJ可能通过调控或间接作用Lm细胞壁结构，调控噬菌体感染受体，影响其作用效率。噬菌体预处理细胞可缓解Lm内化后对线粒体的损伤，而inlJ基因缺失可削弱Lm毒力，又增强其对噬菌体的敏感性，形成“InlJ调控Lm毒力→影响噬菌体识别受体→间接缓解细胞损伤”的调控链。靶向抑制InlJ可直接削弱Lm毒性，从源头阻断感染进程，完善了经典的以InlA/InlB为靶点的内化侵袭作用机制，此外，下调inlJ表达可提升Lm对噬菌体的敏感性，为抗胞内Lm感染提供了新思路。

作者简介

通信作者：

张辉 研究员，博士生导师，主要从事人兽共患病原污染监测与控制技术研究，重点关注基于噬菌体的生物防控关键技术及其衍生产品的开发。中国生物工程学会噬菌体技术专委会委员，中国畜牧兽医学会动物微生态学分会理事，主持国家自然科学基金、国家重点研发计划政府间国际合作专项、农业部行业标准等多项基金项目，在知名期刊发表论文80余篇，授权发明专利20 项，入选江苏省“333人才工程”及“六大人才高峰”高层次人才，成果先后荣获江苏省科学技术二等奖、江苏省优质发明专利奖等。

第一作者：

刘景新，扬州大学食品科学与工程学院硕士研究生。主要从事食源性病原菌的功能基因挖掘及机制研究。

引文格式：

刘景新, 柏梅, 涂武祥, 等. 内化素InlJ对噬菌体抗胞内单核细胞增生李斯特菌感染的影响[J]. 食品科学, 2026, 47(9): 155-162. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251113-099.

LIU Jingxin, BAI Mei, TU Wuxiang, et al. Effect of internalin InlJ on phage-mediated suppression of intracellular Listeria monocytogenes infection[J]. Food Science, 2026, 47(9): 155-162. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251113-099.

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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