Nature | 自动化测试全新遗传密码：tRNA末端CCA并非不可改变

撰文 | 水王星

遗传密码（genetic code） 是生命将DNA中的遗传信息转化为蛋白质氨基酸序列的核心规则，标准遗传密码使用64个密码子编码20种经典氨基酸，这一规则在几乎所有生命形式中高度保守。 合成遗传密码（synthetic genetic code） 的重构赋予了生物体抗病毒性、限制水平基因转移等新特性，也使得超过400种非标准氨基酸（non-standard amino acid,nsAA） 能够掺入蛋白质，为生物材料、治疗药物和生物催化剂的合成开辟了新路径。

然而，在整个基因组层面重编码超过少数几个有义密码子仍然极具挑战，将多种非标准氨基酸高纯度地掺入多肽同样困难重重。无细胞翻译系统为遗传密码的快速测试提供了替代方案，其中 裂解液系统 保留了天然tRNA修饰和完整翻译机器，更接近体内环境，但宿主自带的全套tRNA会与重编码密码子产生 串扰 ； 而由纯化组分重构的PURE系统虽然便于精确控制tRNA组成，却缺少天然细胞环境中的完整tRNA修饰，且规模化制备成本较高。如何在避免串扰的同时高效测试全新遗传密码，亟需一种自动化、多重化的原型设计平台。

近日， 哈佛医学院遗传学系George M. Church教授团队 （第一作者Felix Radford） 在Nature发表题为Automated prototyping of genetic codes的研究论文，开发了名为AGENTEX（Automated Genetic tRNA Expansion，自动化遗传tRNA扩展）的机器人工作流程，可在无细胞翻译系统中多重化原型设计全新遗传密码。研究发现， 尽管tRNA 3′端的CCA序列在自然界中高度保守，但它并非不可改变 。 研究人员 将其中的碱基替换后，许多非CCA末端tRNA仍能被大肠杆菌的天然氨酰-tRNA合成酶识别并连接上相应的氨基酸。研究团队由此构建了一套非CCA末端tRNA，并结合能够识别它们的工程化核糖体，成功构建和测试了压缩遗传密码。这类携带非CCA末端的tRNA被称为正交tRNA（orthogonal tRNA,otRNA） 。在此基础上，研究团队成功构建并测试了压缩遗传密码，实现了非标准氨基酸掺入，并重新指定了3个密码子的编码含义，完整验证了并行遗传密码的可行性。

为系统测量合成tRNA池的氨酰化水平，研究团队开发了tSCAN（tRNA sequencing of charging by automated NGS） 方法。该方法利用高碘酸氧化原理，已氨酰化的tRNA其3′端腺苷酸受到氨基酸保护而保留完整，未 氨酰化 的tRNA则在后续化学处理（β消除，一种可去除未保护末端核苷酸的化学反应）后丢失末端腺苷酸，通过高通量测序定量完整与截短读段的比例即可推算每种tRNA的氨酰化效率。整个流程在Opentrons OT-2开源机器人平台上实现全自动化，可同时测试大量tRNA设计。研究团队还进一步开发了基于质谱的 tSCAN-M 方法，利用同位素标记ATP在体外转录特定tRNA，直接在裂解液中鉴定tRNA上连接的氨基酸种类。

tSCAN流程

借助tSCAN，研究团队首先测试了大肠杆菌tRNA库中CCA序列第二位点简并（CNA）的突变体，即3′端分别为CGA、CUA和CAA的tRNA。结果令人意外：在裂解液系统中，大肠杆菌的全部氨酰tRNA合成酶都能有效氨酰化大多数 非CCA末端tRNA ，其中CGA末端tRNA整体 氨酰化 水平最高。相比之下，在缺乏tRNA修饰的PURE系统中，仅约62%的CGA末端tRNA能被氨酰化，CUA和CAA末端的比例更低。这一差异提示，完整的细胞裂解液环境有助于非经典末端tRNA的氨酰化，作者推测天然tRNA修饰可能是其中的重要原因。

为进一步验证tRNA修饰的作用，研究团队对比了所有大肠杆菌天然tRNA在裂解液和PURE系统中的氨酰化水平 。结果显示，裂解液中tRNA的平均氨酰化水平显著高于PURE系统，II类氨酰tRNA合成酶识别的tRNA（尤其是丝氨酸和苏氨酸tRNA）受修饰影响最为明显。AlphaFold3结构建模提示，CCA突变为CGA可能导致空间位阻差异和π-π堆积（芳香环之间的堆叠相互作用）的丢失，从而影响tRNA与合成酶的结合。在此基础上，研究团队进一步将CCA末端的前两个碱基（第74和75位）全部简并，绘制了完整的氨酰化耐受图谱，证实许多替换组合都能被氨酰tRNA合成酶接受，部分tRNA（如缬氨酸和苯丙氨酸tRNA）表现出尤其广泛的序列耐受性。

既然otRNA能被天然氨酰tRNA合成酶广泛氨酰化，它们是否会被天然核糖体错误地用于翻译呢？ 研究团队设计了一个名为MP1的工程化tRNA混合物，其中丙氨酸tRNA与丝氨酸tRNA的反密码子被交换，用于测试这些tRNA是否会被野生型核糖体错误用于翻译。 结果显示，野生型核糖体严格筛选tRNA的3′端，完全不接纳CGA末端tRNA，未检测到任何串扰事件。这表明，核糖体而非氨酰tRNA合成酶，才是维持遗传密码忠实性的核心过滤器。基于这一发现，研究团队将携带G2251C和G2553C双突变的 CGA核糖体 （其23S rRNA可特异性识别CGA末端）引入裂解液，构建了AGENTEX正交翻译系统。该系统中，CGA核糖体特异性接纳otRNA，而野生型核糖体继续使用天然tRNA，两套翻译系统并行运作且互不干扰。

MP2包含22种工程化tRNA：20种延伸tRNA分别对应20种经典氨基酸，另有1种起始甲硫氨酸tRNA和1种读取UAG的正交tRNA。通过精简每种氨基酸所需的解码tRNA，这套系统形成了一种压缩遗传密码 。 其中20种经典氨基酸各由一个otRNA解码，丝氨酸与丙氨酸密码子交换，UAG密码子则由詹氏甲烷球菌（ Methanocaldococcus jannaschii ）的正交tRNA解码，用于掺入非标准氨基酸对叠氮苯丙氨酸（para-azido phenylalanine, pazF）。基于HiBiT荧光素酶片段互补的高灵敏度报告实验显示，在CGA核糖体和MP2 tRNA池存在时，正确翻译产物的荧光信号比野生型核糖体条件高约6倍，比无模板对照高约10倍。高灵敏度质谱分析进一步证实，在CGA核糖体裂解液中同时检测到了压缩密码和标准密码翻译的多肽产物，且未发现任何丙氨酸/丝氨酸混合的串扰肽段；而在野生型核糖体裂解液中仅检测到标准密码产物。这些结果证明，两套遗传密码可在同一翻译系统中并行运行，且保持高度正交性。

压缩遗传密码的设计

该工作首次实现了遗传密码的全自动化多重化原型设计，揭示了tRNA 3′端CCA序列这一自然界最保守序列之一的意外突变灵活性，修正了对遗传密码维持机制的传统认知。研究建立的AGENTEX平台和tSCAN/tSCAN-M方法，为快速测试远离天然状态的全新遗传密码提供了标准化工具，有望在基因组工程、非标准单体生物聚合物合成、翻译系统进化研究等领域发挥重要作用，并为构建携带并行遗传密码的全新生物体奠定基础。

AGENTEX工作流与压缩遗传密码设计示意图

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10949-y

制版人： 十一

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