弄懂 ChIP-seq 分析，看这一篇就够了

在做表观遗传研究的时候，几乎必须要做 ChIP-seq。

我们通常在关于研究转录因子、组蛋白修饰或者增强子的文章中，会看到这样的描述：H3K27acChIP-seq、H3K27me3ChIP-seq、TF ChIP-seq、Peak、TSS、Motif、IGV、Heatmap……那么：

• ChIP-seq 到底测到了什么？

• 为什么测序之后会出现一个个「峰」？

• 常说的 Peak 越高意味着什么？

• ChIP-seq 的 Heatmap、Profile、Motif 和 IGV 图到底应该怎么看？

图 1：https：//www.mdpi.com/2073-4425/12/5/640

ChIP-seq 到底是干什么的？

ChIP-seq 的全称是：Chromatin Immunoprecipitation Sequencing，染色质免疫沉淀测序。代表了「某个蛋白或者某种组蛋白修饰，在基因组的哪些位置富集。」

例如：假设我们发现一个转录因子 TF-A 能够促进肿瘤细胞增殖。

如果想弄清楚 TF-A 究竟结合了哪些基因进而发挥作用的，这时候就可以做：TF-A ChIP-seq 来探索 TF-A 直接调控的 Gene X，找到结合 Gene X 附近的某个调控区域。

如果研究的是表观遗传修饰，则可能换成：H3K27acChIP-seq，H3K4me3ChIP-seq，H3K27me3ChIP-seq 等，它们分别代表不同的染色质修饰在整个基因组中的分布。

ChIP-seq 的核心原理

ChIP-seq 看起来很复杂，但核心逻辑可以浓缩成两个步骤：

第一步：利用抗体把我们感兴趣的染色质片段富集出来。

第二步：把这些 DNA 片段打断进行测序，再看看它们来自基因组什么位置。

例如我们想研究：H3K27ac 修饰。

1）首先需要把细胞中的蛋白质与 DNA 进行交联（蛋白—DNA 相互作用状态「固定」）

2）然后把染色质打断成较小片段，此时体系中存在大量不同的 DNA 片段，有些片段上带有 H3K27ac 修饰，有些没有。

3）然后加入 H3K27ac 抗体，抗体会识别带有相应修饰的组蛋白（与 H3K27ac 相关的染色质片段富集出来）。

4）随后解交联、纯化 DNA、建库并进行高通量测序。

5）测序之后，再把这些 DNA 序列比对回参考基因组，就知道 H3K27ac 主要富集在基因组的哪些位置。

图 2：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/512151222

为什么 ChIP-seq 结果会出现一个个「峰」？

如果某个区域存在大量目标蛋白结合，比如：某个转录因子大量结合在 Gene A 启动子附近。那么这个位置的 DNA 片段就会被大量富集。

测序后会发现：很多 reads 都集中在基因组同一个区域。把 reads 覆盖度画出来以后，就会出现一个凸起。也就是我们常说的：Peak——峰。所以 ChIP-seq 中的 Peak，代表目标蛋白或组蛋白修饰相对富集的基因组区域。

由于测序本身就可能存在背景，某些基因组区域由于染色质开放程度、DNA 片段化、扩增偏好或者比对特性等原因，本身就可能出现较高 reads。所以，一个区域 reads 多，并不能直接判定为该区域有结合蛋白，必须比较：ChIP 组 vs Input 背景。

如果某个区域在 Input 中信号一般，而在 ChIP 中明显富集，才是真正的阳性结果。

拿到 ChIP-seq 数据以后，要经历哪些分析？

一个比较常见的 ChIP-seq 分析流程可以概括为：

原始 FASTQ 数据——测序质量控制——去除接头及低质量序列——比对到参考基因组——过滤低质量比对/重复 reads 等——样本质量评估——Peak calling——Peak 注释——Peak 分布分析——差异 Peak 分析——Motif 分析——GO/KEGG 等功能富集——IGV 可视化——与 RNA-seq、ATAC-seq 等数据联合分析

所以接下来重点讲：拿到分析报告以后，这些图到底怎么看。

1）第一张图：Peak 图怎么看？

Peak calling 之后，我们会得到成千上万个 Peak。

每个 Peak 通常包含：染色体位置，Peak 起始位置，Peak 终止位置，富集强度，显著性等信息

例如：chr1：100000–100500 代表在 1 号染色体的这一段区域发现了显著富集。

需要特别注意：Peak 本身首先是一个基因组坐标，并不是一个基因。常说的「这个 Peak 属于哪个基因」，实际上是进一步进行 Peak annotation 得到的结果。

图 3：https：//cloud-seq.com.cn/productinfo/3758289.html

2）第二张图：Peak Annotation 怎么看？

研究者常关注这些 Peak 都位于基因组什么位置？因此会进行 Peak 注释。

常见区域包括：Promoter（启动子）Exon（外显子）Intron（内含子）Intergenic region（基因间区）以及不同距离范围的 TSS 附近区域。最后常常画成饼图或者柱状图。

例如某个转录因子的 ChIP-seq 结果可能显示：

图 4：https：//blog.csdn.net/weixin_43569478/article/details/108079441

这意味着该转录因子的结合并不局限于启动子，也可能大量存在于远端调控区域。

而某些组蛋白修饰则具有比较典型的分布特点。

例如：

H3K4me3 通常与活跃启动子密切相关。

H3K27ac 常见于活跃启动子和增强子。

H3K27me3 则通常与 Polycomb 介导的转录抑制状态相关。

因此，看到不同 ChIP-seq 类型时，用不同的思路解释 Peak。

图 5：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/664855989

3）TSS Profile Plot 怎么看？

图 6：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/664855989

横坐标：TSS 上游 → TSS → TSS 下游

纵坐标：ChIP-seq signal

这叫：TSS enrichment profile（转录起始位点）。

这张图能告诉我们：我们研究的蛋白或组蛋白修饰，在所有基因的 TSS 附近总体呈现怎样的分布。

例如 H3K4me3 通常会在活跃基因启动子/TSS 附近出现明显富集。

如果某种修饰在 TSS 附近形成明显峰值，就说明从全基因组平均水平看，它倾向于富集在转录起始区域附近。

4）Heatmap 怎么看？

通常 TSS Profile 旁边还会跟着一张非常漂亮的热图。

图 7：https：//blog.csdn.net/Igenebook/article/details/128315507

• 横坐标：TSS -3 kb → TSS → TSS +3 kb

• 纵坐标：不同基因或者不同 Peak 区域

• 颜色：代表 ChIP-seq 信号强度。

首先看信号集中在哪里，如果主要集中在 TSS 中心附近，说明该修饰倾向于启动子附近富集。

其次看：信号宽还是窄？有些转录因子往往形成相对局部的峰，而某些组蛋白修饰可能覆盖更宽的染色质区域。

最后看：两组之间有没有整体变化？

因此 Heatmap 特别适合展示：全局层面的染色质变化。

5）IGV 轨迹图怎么看？

IGV （Integrative Genomics Viewer）可以把 ChIP-seq 信号直接展示在具体基因组位置上。

例如我们猜想：转录因子 TF-A 调控 Gene X，就可以打开 Gene X 区域。就可能会看到：

图 8：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/687568552

因此 IGV 图比较适合在文章中作机制展示。

6）Motif 分析到底在分析什么？

Motif 就是某些 DNA 结合蛋白偏好识别的特定 DNA 序列模式。

例如我们把所有显著 Peak 对应的 DNA 序列提取出来，如果某个 DNA 区域反复出现，就说明识别该 motif 的转录因子可能参与这些区域的调控。

例如我们做的是：H3K27acChIP-seq，发现新增的 H3K27acPeak 中富集了 TF-A motif。那可以猜想 TF-A 可能参与建立或维持这些活性调控区域。

图 9：https：//blog.csdn.net/swindler_ice/article/details/128770076

举个完整例子：怎么从 ChIP-seq 找到一个机制？

假设我们发现：某个表观遗传酶 A 在肿瘤中高表达。

敲低 A 以后，我们做：H3K27acChIP-seq + RNA-seq。

第一步发现：A 敲低后，部分 H3K27acPeak 明显下降。

第二步：把这些 Loss Peaks 进行基因注释，发现其中很多位于免疫相关基因附近。

第三步：RNA-seq 发现这些基因同时表达下降。于是取交集：H3K27ac↓ + mRNA↓ 筛选出 Gene X。

第四步：IGV 显示 Gene X 附近 H3K27ac 明显降低。

第五步：ChIP-qPCR 进一步验证：敲低 A 以后，Gene X 调控区域 H3K27ac 降低。

第六步：qPCR 和 Western blot 发现 Gene X 表达降低。

最后再进行：Gene X 回补实验。

如果回补 Gene X 能够部分逆转 A 敲低产生的生物学表型，就可以形成完整的机制路线：A——Gene X 调控区域染色质状态改变——Gene X 转录改变——下游生物学表型改变。

编辑：小 z

题图：图虫