苏州大学Angew：抗菌肽，只在感染处激活

分层门控DNA纳米开关实现抗菌肽的感染部位选择性激活

尿路感染难以根治，核心原因在于尿路致病性大肠杆菌可形成生物膜和胞内储库，从而逃避抗生素与免疫监视；生物膜致密基质阻碍药物渗透，使细菌长期暴露于亚致死浓度并促进复发，氟喹诺酮类和呋喃妥因等常用抗生素的失败率已超过30%。膜裂解肽通过破坏细菌包膜发挥强效抗菌作用，但蜂毒肽等肽的膜裂解活性与宿主毒性内在耦合，治疗剂量下易导致溶血和全身毒性。现有pH响应或酶响应递送系统多依赖单一触发线索，难以区分细菌感染微环境与健康或炎症宿主组织，因此如何将递送与条件激活耦合、把膜裂解效力与全身毒性解耦，仍是抗菌肽治疗的核心挑战。DNA纳米技术具备纳米级结构精度、位点可寻址性和功能组件模块化整合能力，但利用DNA折纸将多个生物信号整合为协同控制方案以实现抗菌激活仍待探索。

针对这一挑战，苏州大学王后禹教授、何耀教授、Lu xing合作，设计了一种分层门控DNA纳米开关，将细菌趋向性、微环境传感和炎症相关酶激活三层控制逻辑编码于单一DNA折纸支架，使蜂毒肽仅在感染部位被激活。麦芽糊精配体空间编程后结合细菌特异性麦芽糊精转运体，实现选择性细菌识别并使结合增强2.3个数量级；富含胞嘧啶的i-motif锁在酸性生物膜条件下驱动支架构象打开；caspase-1可切割肽系链在炎症线索下提供最终酶门控。该分层门控以高时空精度限制膜裂解活性，抑制脱靶溶血和全身渗漏；在尿路致病性大肠杆菌相关尿路感染模型中，纳米开关实现与环丙沙星相当的体内细菌清除，展示出可推广的条件性肽激活策略。相关论文以“Hierarchically Gated DNA Nanoswitches Enable Context-Selective Activation of Antimicrobial Peptides”为题，发表在Angew上。

研究首先将三层门控集成到DNA折纸纳米开关中：静息状态下支架呈管状货物封闭构象，由富含胞嘧啶的i-motif紧固件稳定，生理pH下紧固件与互补链形成双链而维持关闭（图1a）；弱酸性条件下质子化驱动的i-motif折叠竞争双链相互作用，导致紧固件解离和支架打开，暴露肽系链以供caspase-1切割（图1a）。麦芽糊精配体被排列在纳米片末端附近以偏向细菌结合（图1a），蜂毒肽则通过caspase-1可切割肽连接子共价系于支架中央（图1a）。原子力显微镜直接观察到pH依赖的管状到片状转变（图1a）；FRET、琼脂糖凝胶电泳及在合成尿和天然尿中的稳定性分析进一步支持支架完整性。细菌趋向性、酸性触发和酶切释放可协同而非独立运行，从而减少循环和非感染组织中的过早激活（图1b）。

图1：用于蜂毒肽背景选择性激活的分层门控DNA纳米开关。a，DNA折纸纳米开关的设计与工作原理，整合细菌识别、pH响应结构打开和酶促肽释放；支架在生理pH下保持紧凑，在弱酸性条件下打开，暴露肽系链以供后续caspase-1切割（比例尺，50 nm）。b，协同作用概念图：细菌结合使纳米开关富集于感染部位，微环境酸性触发支架打开，炎症酶释放蜂毒肽，实现局部抗菌活性同时限制脱靶毒性。

在明确分层门控设计后，研究利用矩形DNA折纸的位点可寻址性编程蜂毒肽价态和空间组织。通过捕获链与互补poly-A连接子将蜂毒肽偶联物定点附着（图2a），构建含2、4、6、9或12个肽的阵列（图2b），并以抗菌实验和AFM评估价态对杀伤效率和组装产率的影响（图2c–e）。结果显示抗菌活性随肽数增加而在9位点配置达到平台（图2c、d），12位点无进一步改善且组装产率下降（图2e）；9位点纳米开关MIC为25 nM，相对游离蜂毒肽200 nM名义提高八倍，但实测每个折纸负载8.30±0.74个蜂毒肽分子，说明性能提升更应归因于纳米开关介导的细菌富集、肽保护和局部释放，而非简单降低肽需求。该结果将肽价态和空间排列确立为调节抗菌效力与支架稳定性的功能控制层，并确定9位点配置用于后续研究（图2c–i）。

图2：在DNA折纸支架上编程肽价态和空间组织。a，通过互补捕获链实现蜂毒肽的位点可寻址附着，在折纸表面形成确定肽阵列。b，携带递增数量蜂毒肽分子的支架原子力显微镜图像：0（i）、2（ii）、4（iii）、6（iv）、9（v）和12（vi）个位点（比例尺，100 nm）。c，不同肽价态构建体对尿路致病性大肠杆菌的代表性抗菌实验。d，对应c图的CFU定量。e，每种加载配置的组装产率，表明较高肽密度下结构保真度降低。f，优化九位点配置的大面积原子力显微镜图像，突出肽锚定位点（比例尺，125 nm）。g–i，优化支架的尺寸分析和肽间距（比例尺，50 nm）。数据为均值±标准差（n=3）。统计显著性采用单因素方差分析。

为使门控真正转化为抗菌效力，研究进一步验证麦芽糊精功能化能否建立转运体介导的细菌识别第一层。MD通过氨基修饰寡核苷酸杂交和Schiff碱化学偶联到折纸表面（图3a）；粒径和zeta电位未见明显改变。利用LamB或MalE缺失的UPEC菌株、共聚焦和流式细胞术证明，MD-rDON与野生型UPEC强结合，而转运体缺陷菌株结合极少（图3b、c），过量游离MD竞争可使结合降至约3.5%，说明结合依赖完整麦芽糊精摄取通路而非非特异性吸附。在成熟UPEC生物膜中，MD-Mel-rDON相对PBS使残余生物量降低约69%，清除效果优于缺乏MD靶向的pH-Mel-rDON（图3d–f）；与哺乳细胞共培养时荧光局限于细菌而未见宿主膜积累。由此，MD功能化通过选择性富集纳米开关于细菌表面和生物膜基质，为后续pH和酶门控创造正确的生物背景（图3b–f）。

图3：转运体介导的细菌识别和生物膜结合。a，通过延伸链在折纸表面安装麦芽糊精配体。b，共聚焦图像显示麦芽糊精修饰纳米开关与尿路致病性大肠杆菌的选择性结合，与流式细胞术分析一致（比例尺，40 µm）。c，孵育4 h后与野生型和麦芽糊精转运体缺陷尿路致病性大肠杆菌菌株结合的流式细胞术定量。d，成熟尿路致病性大肠杆菌生物膜经游离蜂毒肽、Mel-rDON或MD-Mel-rDON处理后的三维共聚焦激光扫描显微镜重建（比例尺，40 µm）。e，残留生物膜基质的结晶紫染色。f，通过590 nm吸光度定量生物膜生物量。数据为均值±标准差（n=3）；双尾非配对t检验。

在实现细菌富集后，研究检验酸性和炎症酶能否作为协同激活步骤。pH约7.5时i-motif紧固件维持管状封闭形态，pH≤6.5时质子化驱动紧固件解离、支架打开并暴露肽系链（图4a）；AFM直接观察到管状到片状的可逆转变（图4a），FRET监测显示结构切换与打开闭合一致（图4d）；pH滴定和pH不敏感对照进一步支持i-motif特异性。功能上，酸性条件下纳米开关处理使UPEC存活细菌降至碱性条件的约23%（图4e、f）；扫描电镜显示明显膜破坏。caspase-1处理可从完整组装纳米开关释放蜂毒肽，VX-765抑制切割并减弱抗菌活性，而胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K均未见相当切割；荧光光谱显示caspase-1依赖性肽系链切割（图4g）。该结果说明纳米开关要求酸性微环境和炎症蛋白酶活性同时满足，形成协同“AND门”逻辑，将肽释放限制于感染相关背景（图4a–g）。

图4：DNA纳米开关的pH和酶响应激活。a，示意图和原子力显微镜图像显示不同pH条件下紧凑和开放构象之间的可逆转变（比例尺，100 nm）。b，紧凑（管状）纳米开关状态的高度剖面。c，AlphaFold3预测的i-motif紧固件对结构模型。d，基于FRET监测pH 7.5和pH 6.5下纳米开关的打开和关闭。e，中性和酸性条件下负载蜂毒肽纳米开关的抗菌活性（100 nM，24 h）。f，对应e图的CFU定量。g，显示caspase-1依赖性肽系链切割的荧光光谱。数据为均值±标准差（n=3）。

在确认定位和结构开关后，研究评估分层门控能否在体外抑制脱靶细胞裂解。以实验测定负载换算等效肽剂量，CT26细胞活–死染色显示游离蜂毒肽和未折叠MD-Mel-rDON的PI阳性群体分别达43.8%和45.9%，而门控纳米开关与PBS对照相当约3%（图5b、d）；HEK-293细胞TUNEL染色和MTT实验进一步显示，门控纳米开关在相关处理窗口内维持>98%活力，未折叠构建体则明显降低活力（图5c、e、f）。值得注意的是，仅将蜂毒肽偶联到DNA支架虽中和其正电荷，但无环境门控时MD-Mel-rDON仍高毒（图5b–f），说明有效解毒不能仅靠电荷屏蔽，而需要物理封闭与pH/酶条件释放共同作用（图5b–g）。该体外结果将分层门控与“简单载体结合”区分开来（图5b–g）。

图5：分层门控在体外抑制脱靶细胞裂解活性。a，示意图说明暴露蜂毒肽引起的膜破坏以及门控封闭的抑制。b，PBS、游离蜂毒肽、MD-Mel-rDON或门控纳米开关处理后CT26细胞的活–死染色（比例尺，20 µm）。c，相同处理后HEK-293细胞的TUNEL染色（比例尺，40 µm）。d、e，来自b图和c图的膜损伤和凋亡定量。f，暴露于指示制剂后HEK-293细胞的细胞活力测量。g，门控纳米开关的时间依赖性细胞毒性曲线。数据为均值±标准差（n=3）；双尾非配对t检验。

在体外解毒基础上，研究进一步在健康小鼠中考察全身毒性。尾出血实验显示游离蜂毒肽使出血时间由PBS约5.6 min延长至约21.6 min，而门控纳米开关约6.1 min，与PBS不可区分（图6b、c）；红细胞溶血实验中门控纳米开关溶血率约1.8%，游离蜂毒肽则造成广泛溶血（图6d、e）。血液学与生化指标以及膀胱H&E染色进一步表明，游离蜂毒肽和Mel-rDON诱导白细胞、中性粒细胞、尿素升高及组织损伤，而门控纳米开关各项指标与PBS相当（图6f、g）。尤其Mel-rDON虽携带蜂毒肽但缺乏pH响应结构封闭，仍表现与游离肽相近的毒性（图6c–g），说明安全性来自结构隔离与条件释放的分层控制，而非仅载体偶联（图6c–g）。

图6：分层门控在体内抑制全身毒性。a，示意图说明蜂毒肽诱导的溶血及其被纳米开关封闭抑制。b，尾出血实验的工作流程。c，给予PBS、游离蜂毒肽、Mel-rDON或门控纳米开关后的出血时间。d，通过540 nm吸光度定量红细胞溶血。e，孵育后红细胞沉淀的代表性图像。f，治疗后的血液学和生化指标。g，H&E染色的膀胱切片显示不同处理后组织完整性（比例尺，500和50 µm）。数据为均值±标准差（n=3）；双尾非配对t检验。

最终，研究在UPEC诱导的小鼠急性尿路感染模型中验证背景选择性治疗。小鼠经尿道连续滴注UPEC建立感染后（图7a），每日经膀胱给予PBS、游离蜂毒肽、Mel-rDON、MD-Mel-rDON、门控纳米开关或环丙沙星，连续三天，终点定量肾脏和膀胱细菌负荷并评估组织病理和炎症因子（图7a）。门控纳米开关使膀胱细菌负荷相对PBS降低约95%，肾脏呈相似趋势，疗效与环丙沙星相当（图7b、c）；大体形态改善、组织架构基本完整、巨噬细胞浸润较少（图7d–f），膀胱和肾脏TNF-α分别降低约81%和85%，IL-6分别降低约76%和70%（图7g–j）。控制构建体在体内也显示明显抗菌活性（图7b、c），当前数据尚不能定量区分MD靶向和pH响应调节各自的贡献，但整合纳米开关在有效清除细菌的同时保持良好安全窗口，支持分层门控在体内的治疗可行性（图7a–j）。

图7：急性尿路感染中背景选择性治疗的体内验证。a，尿路感染诱导、治疗和组织分析的实验时间线。b–c，用PBS、游离蜂毒肽、Mel-rDON、MD-Mel-rDON、门控纳米开关或环丙沙星治疗后肾脏（b）和膀胱（c）中的细菌负荷。d，代表性组肾脏和膀胱的大体形态。e，肾脏和膀胱组织的H&E染色；f，CD68免疫染色（比例尺，1000 µm和100 µm）。g–j，治疗后肾脏和膀胱中TNF-α和IL-6水平。数据为均值±标准差（n=3）；单因素方差分析。

综上，该研究通过DNA折纸纳米开关将转运体介导的细菌识别、pH依赖结构打开和炎症相关caspase-1切割三层门控协同整合，使蜂毒肽在生理条件下保持屏蔽、仅在感染相关线索同时出现时释放。研究证明破坏任一门控层都会削弱效力或安全性，肽价态与空间组织也是调节抗菌性能和组装保真度的重要功能层；分层门控在体外和体内抑制游离蜂毒肽的细胞毒性和全身毒性，同时在急性尿路感染模型中保持与环丙沙星相当的抗菌效果。该策略将动态结构封闭与条件释放结合，实现膜裂解效力与全身毒性的解耦，为把多层生物决策编程进DNA纳米结构提供了通用框架，并有望扩展到其他受脱靶效应限制的生物活性剂。