华东理工大学JACS：液-液相分离驱动聚合，水相无催化剂合成高分子量聚二硫化物

液-液相分离是生物系统中普遍存在的动态物理过程，通过无膜细胞器将小分子和聚合物等生物分子区隔化，从而调节反应、构象和功能；与囊泡和胶束不同，LLPS形成的液滴没有膜边界，处于亚稳态且高度动态。合成化学中，小分子或大分子构建块已分别被证明可发生LLPS， 但（大）分子实体的区隔化如何偏置由可逆共价键介导的动态聚合物系统的组成平衡，仍是尚未解决的关键挑战。

针对这一问题，华东理工大学张琦教授课题组报道了一种通过LLPS进行动态共价聚合的合成超分子系统。该系统以氨基酸和二硫化物等生物相关构建块为基础，在涉及多重弱而可逆化学键的凝聚微环境中工程化小分子与聚合物之间的组成动态；无序液滴内的区隔化既提高了二硫键介导开环聚合的热力学驱动力，又在动力学上激活了二硫键动态，从而在水中自发、无催化剂地合成高分子量聚二硫化物。所得聚合物形成热力学稳定的自缠结水凝胶，脱水后可定量光化学解聚，再生原始品质单体。相关论文以“Dynamic Covalent Polymerization through Liquid–Liquid Phase Separation”为题，发表在JACS上。

在方法设计上，研究者将二硫键介导的开环聚合与氢键及亲水/疏水相互作用整合于同一可发生LLPS的水相体系，设计出以六乙二醇为亲水链、二肽为疏水间隔基的两亲性1,2-二硫杂环戊烷单体（图1b）。该油状单体溶于水后先呈视觉均相，1 min内出现小液滴，数分钟内溶液变浑浊，液滴持续融合长大，老化后形成与上清相分离的半透明水凝胶（图1c、图1d、图1f）。CLSM显示液滴及其融合行为（图1e、图1f），FRAP进一步确认液滴的液体性质；cryo-SEM和流变分析显示水凝胶为互连的三维聚合物纤维网络和典型橡胶平台，GPC测得共价聚合物Mₙ可达400 kDa（相对于聚苯乙烯标准），所得水凝胶网络可由CLSM直接观察（图1g）。与常规有机相开环聚合需要高浓度、催化活化和低温不同，该LLPS驱动体系无需外部催化剂、引发剂或惰性气氛，即可在水介质中实现高于90%的单体转化率（图1a）。

图1 液-液相分离驱动的动态共价聚合。A) 常规有机相中1,2-二硫杂环戊烷开环聚合（左）与本研究中1,2-二硫杂环戊烷自发开环聚合（右）的能量景观示意图；B) ALLH、单体和聚合物的分子结构；C) 两亲性单体自发液-液相分离及随后LLPS驱动开环聚合形成长链聚二硫化物自缠结水凝胶网络的示意图；D) ALLH溶于去离子水后LLPS驱动开环聚合的代表性照片，单体浓度0.5 M；E) 所形成液滴的代表性共聚焦激光扫描显微镜图像，比例尺：10 μm；F) 液滴融合行为的快照，比例尺：10 μm；G) 所得聚(ALLH)自缠结水凝胶网络的代表性激光共聚焦显微照片，比例尺：10 μm；染料：DMSO中1 mM尼罗红；v/v=1:100。

为揭示LLPS驱动聚合的动力学和微环境机制，研究者结合时间分辨SAXS、液相FT-IR、GPC和CLSM发现，聚合过程中Mₙ增长与单体消耗几乎同步，但动力学曲线呈现多段增长斜率（图2a）；SAXS显示球形液滴形成及纳米尺度相分离增强（图2b），FT-IR表明LLPS和水凝胶中侧链二肽处于水合微环境（图2c）。单体转化率和Mₙ随初始单体浓度呈非线性关系（图2d），相应LLPS结构由SAXS和CLSM显示（图2e、图2f）。盐和pH可通过改变LLPS行为调节聚合（图2g、图2h），其中强水合金属阳离子可降低凝聚液滴内水含量、提高有效单体浓度；温度则呈现先升后降的“火山”形依赖，最佳温度为25–28 °C。水既通过疏水作用驱动LLPS，又可能以羟基或弱自电离产生的氢氧根作为引发剂来源，生成硫醇末端聚合物链；Ellman试剂在412 nm处的特征吸收支持硫醇末端聚合物链的存在。

图2 液-液相分离驱动聚合的动力学分析和微环境因素。A) ALLHL溶于水后5至75 min内单体转化率和Mₙ的动力学曲线，初始单体浓度0.5 M，T=25 °C；数均分子量Mₙ通过GPC以标准聚苯乙烯为参照监测，洗脱液为四氢呋喃；B) LLPS系统的时间分辨SAXS曲线，q为散射矢量；C) LLPS混合物在D₂O中（0.5 M，蓝色）、所得水凝胶（绿色）和干燥样品膜（红色）的FT-IR谱；D) 24 h时平衡系统的单体转化率和Mₙ随初始单体浓度（0.001至1 M）的变化；E) 不同初始单体浓度（0.05–0.5 M）LLPS系统的SAXS曲线，数据在单体溶解后320 min采集；F) 不同初始单体浓度（0.05–0.5 M）LLPS中液滴的相应CLSM图像，t=25 min，比例尺：20 μm；G) 不同盐浓度（Li⁺、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺；0.01–1 M）下平衡态单体转化率的热图分布；H) pH对LLPS驱动聚合的影响，三组平行实验分别在pH=4（HCl）、pH=10（NaOH）和pH=10（四甲基氢氧化铵，TMA-OH）下进行；该面板显示系统照片和CLSM图像、LLPS形成的定性评估以及相应单体转化率值，比例尺：10 μm；染料：DMSO中1 mM尼罗红；v/v=1:100。

进一步，研究者通过系统改变二肽侧链残基（图3a）来理解LLPS与开环聚合的热力学耦合。最亲水的AAAHL LLPS倾向差，因缺乏凝聚微环境而检测不到聚合；引入亮氨酸的ALAHL仅形成少量液滴并得到25%的不稳定寡聚物；引入苯基的AFAHL获得67%转化率和124 kDa的Mₙ；ALLHL表现最优，转化率>90%、Mₙ约400 kDa；更疏水的ALFHL虽快速LLPS，却因空间位阻在室温下不产生聚合物，升高温度或加入TMA-OH可克服动力学屏障（图3b–图3e）。FRAP和MD模拟进一步表明，侧链疏水性影响液滴粘度和凝聚紧密程度，过强疏水与芳香堆积可能造成动力学抑制，平衡的单体两亲性是高效LLPS驱动开环聚合的关键（图3f–图3h）。

图3 通过侧链分子工程对LLPS和聚合的热力学控制。A) 单体的通用化学结构；B) 单体化合物的侧链工程及相应水溶液/分散液照片和所得液滴的CLSM图像，比例尺：20 μm；染料：DMSO中1 mM尼罗红；v/v=1:100；C–E) 自由能曲线示意图，说明AAAHL（C）、ALLHL（D）和ALFHL（E）的侧链依赖性LLPS和开环聚合，能量景观根据相应化合物的单体转化率定性估计；F) 通过荧光漂白恢复（FRAP）实验比较单体化合物的液滴流动性；G) ALLH在显式水中50 ns模拟结束时自发聚集的MD模拟快照；H) 50 ns模拟时间内归一化溶剂可及表面积（SASAnorm = SASA(t)/SASA(0)）随模拟时间的变化。

在化学可回收性方面，干燥聚(ALLHL)经365 nm紫外照射并老化后可自发解聚为黄色油状单体（图4a），¹H NMR显示无需进一步纯化即可几乎定量回收原始品质单体（图4b），纯度超过95%，而水合水凝胶在相同照射条件下保持稳定（图4c）。单晶结构显示，ALLM类似物呈反平行、头尾堆叠模式，使二硫键单元与相邻氢键分子在空间上分离，从而不利于分子间二硫键形成，并驱动干燥聚合物趋向热力学更稳定的单体（图4d）；而AFAM/AFAH类似物以平行β-折叠样氢键组装，使聚合物相对单体更稳定（图4e）。水合后水分子打断分子间氢键堆叠，触发自发LLPS并驱动无催化剂开环聚合（图4f）。水蒸气也能触发聚合，干燥ALLHL在25 °C、90% RH下暴露30天可得到聚(ALLHL)，而暗处加热仅引起可忽略的单体增加，说明紫外光通过产生硫自由基加速热力学弛豫。由此，水合/脱水可可逆偏置单体—聚合物平衡，形成闭环循环聚合物系统。

图4 水合控制的聚二硫化物化学可回收性。A) 水凝胶和干燥聚(ALLHL)在紫外照射（λₘ = 365 nm，20 min）并老化20 min前后的照片；干燥聚合物照射后变黄，并自发解聚为黄色油状单体；B) ¹H NMR谱比较（CDCl₃，600 MHz），显示无需进一步纯化几乎定量回收原始品质单体；C) 干燥聚合物样品（橙色曲线）和水合水凝胶（蓝色曲线）的单体回收率随紫外照射时间的变化；D) ALLM的单晶X射线衍射结构，其为ALLHL的类似物；E) AFAM的单晶X射线衍射结构，其为AFAHL的类似物；F) 单体和聚合物之间水合依赖性动态平衡的示意图；由于二硫键单元被分子间氢键在空间上分隔的反平行排列抑制了开环聚合，干燥单体比聚合物更稳定；一旦水合，水分子打断分子间氢键堆叠的结构有序性，并触发自发LLPS过程，驱动单体在无序凝聚液滴中无催化剂开环聚合。

总体而言，该工作提出了LLPS驱动开环聚合这一不同于常规方法的高分子量聚二硫化物合成策略，揭示了凝聚微环境中动态共价键与非共价相互作用之间的微妙耦合，并证明可通过可逆水合偏置单体—聚合物平衡。由氨基酸和二硫键等生物相关构建块构成的全合成系统出现区隔化、链增长和循环性等类生命特征，为仿生系统人工合成提供了基础见解；LLPS受限域中弱化学键的动力学及水的关键作用，也可能为探索生命起源或生物聚合物起源开辟道路，并推动动态、内在无序聚合物在细胞外基质模拟和响应性软材料中的应用。