读懂色谱：反相色谱法（RPC）

顾名思义，在反相色谱法 (RPC) 中，相的性质与正相色谱（NPC）中使用的相不同。在RPC中，固定相的极性低于流动相。这种反转是通过将硅胶表面硅醇基的极性改变为非极性基团来实现的。硅胶填料仍然是 RPC 中最常用的载体。极性硅醇基经过化学修饰后，就变成了非极性的疏水性烃基载体，如十八烷基二氧化硅 (ODS)。图 1 显示了用于制备聚合物或单体固定相的氯硅烷反应。通过改变有机硅烷上的侧链 (R)，可以生产出多种商业化的键合固定相。表 1 列出了通过对硅胶的硅醇基进行化学修饰而制备的一些固定相。

表 1. 化学改性硅胶中的官能团。

在 RPC 中，流动相一般由水或缓冲水溶液与各种水溶性溶剂（如醇类）的混合物组成。从理论上讲，当流动相和固定相之间的极性差异最大时，分离选择性最高。在实际操作中，流动相的溶剂强度与固定相的疏水性相适应，特定溶质的洗脱 K' 值在 2 到 10 之间。

聚合物和单体键合相及末端封端

图 5 所示的反应方案说明了硅醇基与衍生试剂之间一一对应的关系，即每一个硅醇基含有一个 R 基团。这种类型的相称为单体相。通过使用三氯烷基硅烷而不是单氯烷基硅烷作为试剂，一对一反应产生的产物可进一步与附近的硅醇基或另一个氯烷基硅烷发生反应，从而形成多个层。这种类型的固定相被称为聚合固定相。由于存在立体阻碍，硅胶上的硅醇基不会全部与衍生试剂发生反应，因此会留下未反应的残留硅醇基。

任何残留的硅醇基都会给固定相带来极性，从而导致极性化合物（尤其是碱）出现拖尾。为了解决这个问题，键合相材料要与小的三甲基硅烷进一步反应，因为三甲基硅烷的尺寸较小，可以更好地接触到未反应的硅醇基。这种方法被称为 "封端法"。许多制造商都声称自己的包装材料是 100% 封端或完全封端的。实际上，仍会有一些未反应的硅醇基残留。

与使用 ODS 色谱柱分析化合物相关的许多问题都可追溯到残留硅醇基的存在。使用酸性流动相可以减少硅醇基的影响。硅醇基的 pKa值约为 3.5，因此在酸性条件下，硅醇基会被质子化，从而降低电离效果。另一种流动相改良方法是在分析碱性化合物时加入 30 至 50 mM 的三乙胺，分析酸性化合物时加入乙酸铵，分析未知化合物时加入乙酸三甲胺。添加 10 mM 的二甲基辛胺或二甲基辛胺乙酸盐可减少 ODS 色谱柱对碱性化合物的色谱特性差异。

碳载量和保留

在 RPC 中，固定相、流动相和样品分子之间的疏水相互作用对保留起着主导作用。烷基键合相的保留受碳载量的影响很大，通常以百分比表示。固定相的含碳量取决于相对表面覆盖率和键合官能团的链长。此外，还取决于硅胶支架的表面积和制造方法--单体、聚合和末端封端。对于 ODS 键合相，碳载量可在 10% 到 20% 之间变化，对于辛基硅烷键合相，该值通常为 5% 到 10%。随着烷基（R）链长度的增加，溶质保留时间也会增加。碳载量越高，固定相的疏水性就越强。

使用聚合物载体的 RPC

在药物的 RPC 中，硅胶固定相仍然是最常用的固定相。不过，基于聚合物（苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）的吸附剂正逐渐受到重视。硅胶吸附剂的主要缺点在于硅胶的 pH 值稳定性。在碱性 pH 条件下，硅胶会缓慢溶解，这会大大缩短 HPLC 色谱柱的使用寿命。基于硅胶的 HPLC 色谱柱流动相 pH 值的有效范围是 2 到 7，而基于聚合物的 RP 高效液相色谱柱在很宽的 pH 值范围内都很稳定，通常为 pH 值 1 到 13。

与硅胶 RP-HPLC 色谱柱相比，聚合物 RPC 色谱柱可以选择更多的流动相，尤其是在分离碱性化合物时。通过在高 pH 值下操作，碱离子化成为可能。聚合载体的主要缺点是聚合效率较低，对高压的机械阻力较小。用于制造聚合物相的交联工艺（图 1）可产生具有良好孔径控制的刚性球形颗粒。因此，它们也非常适合用于体积排阻色谱法。

RPC 的溶剂强度和洗脱能力

对于 RPC 而言，水是最弱的溶剂。在 RPC 中的保留受流动相中水浓度的控制，随着水浓度的增加而降低。其中，在 RPC 中的保留类似于分配过程，而不是 NPC 的吸附过程。表 2 列出了 RPC 中常用溶剂的洗脱能力

反相离子对色谱

对于低质量离子化合物，离子交换色谱法是唯一可行的选择，但现在相当极性的化合物可以通过反相离子对色谱法分离出来。反相色谱和反相离子对色谱使用的色谱柱是相同的。不过，从实用的角度来看，最好还是为离子对色谱单独配备一个色谱柱。离子对色谱法分离离子化合物有两种方法。

第一种方法是调节流动相的 pH 值，使待测物呈中性或未离子化形式。这被称为离子抑制。一般来说，中性形式的可电离化合物的保留率要高于电离形式。流动相和固定相的性质对离子化合物保留的影响与中性化合物基本相同。

使用硅胶色谱柱时，离子抑制方法使用的流动相 pH 值范围仅限于 2 至 7。

影响离子化合物在 RPC 上保留的第二种方法是离子对萃取技术。在这种技术中，通常会调节流动相的 pH 值，使相关化合物处于离子化状态。然后通过在流动相中加入带相反电荷的离子对试剂来控制保留。如下图所示，离子对试剂形成的库仑复合物表现为电中性和非极性化合物。

样品 + 离子对离子 ------[样品 - 离子对离子]

离子对试剂对中性物质的影响微乎其微，但对样品混合物中所有带电物质都有影响。该方法可用于分离同一样品中的离子和非离子化合物。RPC 中常用的酸和碱的离子对离子有：

酸性化合物：季胺，如四甲基氢氧化铵 (TMAH)、四丁基氢氧化铵 (TBAH)、叔胺，如三丁胺。

碱性化合物：高氯酸、烷基和芳基磺酸盐，如甲烷、戊烷、庚烷和樟脑磺酸。

使用硅胶反相柱时，所有离子对离子的流动相 pH 值应保持在 2-7 之间。离子对试剂的浓度通常保持在 50-200 mM 范围内。化合物在反相离子对色谱中的保留受离子对试剂的浓度及其大小的影响。例如，在保持其他条件不变的情况下，将甲烷换成庚烷磺酸作为离子对离子，会导致待测物的保留时间延后。还应通过改变流动相中有机溶剂的量来调整保留时间。