寡核苷酸类药物的1-4类杂质及其限度介绍

寡核苷酸的生产通常采用成熟的亚磷酰胺法，通过自动化的固相树脂化学合成实现，所使用的起始原料源自受保护的2'-脱氧核苷（dA、dC、dG、T）、核糖核苷（A、C、G、U）或化学修饰核苷。寡核苷酸原料药中的杂质来源包括三方面：1）原材料；2）合成过程；3）加工与储存期间的降解。原材料可进一步分为起始物料（如亚磷酰胺、载碱基载体）和其他原材料（如辅助试剂）。水分控制至关重要，因为水分会与亚磷酰胺反应使其失活。按对最终药品的影响，亚磷酰胺杂质可分为三类：1）非反应性且非关键杂质；2）反应性但非关键杂质；3）反应性且关键杂质。此处仅讨论第三类杂质（反应性且关键），因其最终会成为原料药中的杂质。在多数情况下，这些杂质属于非天然物质，因此被寡核苷酸安全工作组（OSWG）2017年白皮书归为IV类杂质。

法规申报中需说明杂质及其产生机制。尽管在初始IND（investigational new drug，新药研究申请）/CTA（clinical trial application，临床试验申请）提交中，这部分内容较为简略，但随着研究药物进入临床开发阶段，需更深入地阐明杂质及其来源，并与监管机构沟通。

为获得目标寡核苷酸序列，按序列顺序在固相树脂上依次偶联，从序列的3'端起始，逐步延伸至5'端。自20世纪80年代初以来，该合成过程已实现全自动化。链组装完成后，通过从固相载体上切割产物、全局脱保护，再经高效液相色谱（HPLC）、超滤和冻干等下游处理实现分离。在每个工艺步骤中，反应不完全或副反应可能导致终产物中产生杂质。不同的生产工艺会产生不同的杂质，因此所采用的生产工艺直接影响杂质谱，需对杂质进行识别、定量，并通过设定质量标准加以充分控制。本文结合2017年寡核苷酸安全工作组（OSWG）白皮书所述指南，对常见杂质进行分类。

2017年OSWG将寡核苷酸药物中的杂质分为四大类。I–III类为非关键杂质，包括代谢产物、母药序列变体或天然存在的核酸结构修饰，无需在毒理学研究中额外评估。IV类为关键杂质，因其非天然来源，需评估毒理特性；生产工艺应最大限度减少IV类杂质的生成。

ICH Q11（EMA，2012）指出，杂质作为原料药的关键质量属性（CQA），可能影响药品安全性。寡核苷酸虽被排除在ICH Q6A、Q3A（有机杂质）、Q3C（残留溶剂）之外，但需遵循其原则制定CMC控制策略。

OSWG 2017年白皮书借鉴ICH Q3A的精神，提出了寡核苷酸杂质鉴定的决策树，并建议了单个杂质的报告、识别和鉴定阈值杂质限度（见下表）。OSWG发布的另外两份白皮书也具有重要参考价值：一份探讨安全药理学评估（Berman等人，2014）；另一份围绕生殖与发育毒性评估，为阈值和限度的设定提供了详细依据（Cavagnaro等人，2014）。这些文件均应在制定寡核苷酸治疗药物的CMC控制策略时予以考虑。

高分辨离子对反相LC-MS是原料药相关杂质CMC控制的核心工具：既可鉴定/定量杂质，又可追溯到“工艺步骤”或“起始物料”以确定杂质来源。为工艺开发提供必要信息，以避免或最大限度降低终产品中的杂质水平。下游加工中，多数杂质可通过柱色谱去除，但亚磷酰胺起始材料中的杂质因与主产物洗脱位置接近，极难（甚至无法）纯化去除。此外，这类杂质会随亚磷酰胺在整个序列中的每次掺入而累积，可能达到临界水平。例如：若亚磷酰胺砌块中含0.05%的关键活性杂质，在20mer寡核苷酸中掺入5次后，粗品中杂质水平可达0.25%；若起始材料中该杂质为0.25%，5次掺入后粗品中杂质可升至1.25%。

起始材料的质量稳定性至关重要，需在供应商或制造商层面严格控制。欧洲制药寡核苷酸联盟（EPOC）（Kiesman等人，2021）已发布相关指南。

杂质的具体分类

Ⅰ类杂质：工艺相关杂质，同时也是母体分子的主要代谢物。因与主要代谢物结构一致，默认已完成毒理学研究。

示例：3'或5'端核苷酸的内切核酸酶降解（n-1）、缀合物或连接子的丢失、尿苷通过脱嘧啶的部分/完全降解（下图所示）、脱嘌呤导致的无碱基位点、2'F基团的消除等。

Ⅱ类杂质：工艺相关杂质，含核酸中天然存在的结构单元，但属于修饰后的母体化合物。因结构为内源性，通常无安全性担忧。

示例：硫代磷酸酯寡核苷酸中的磷酸二酯杂质、氧化碱基（下图所示）、碱基转换、3'端通过环磷酸酯形成的截短、RNA中5'-2'核苷酸键的形成、来自起始材料且天然存在的杂质等。

Ⅲ类杂质：工艺相关杂质，与母体分子的差异仅在于分子序列，不含新结构单元。潜在毒性可能仅限于序列改变导致的脱靶反义效应或免疫刺激（如核苷酸缺失（n-1）、插入（n+1）或替换（如脱氨））。在治疗性反义策略中，这类修饰序列的水平通常过低，难以产生药理效应。

示例：内部缺失（n-1、n-x）、内部插入（n+1、n+x）、胞嘧啶脱氨为尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶脱氨为胸腺嘧啶（下图所示）等。

Ⅳ类杂质：工艺相关杂质，含母体分子及天然核酸中均不存在的结构单元。若其规格限度超过设定的鉴定阈值，需在非临床毒理学研究中评估安全性。

示例：非天然碱基修饰、骨架修饰部分（如起始材料相关修饰，下图所示）、CNET（T碱基与C6-氨基连接子的丙烯腈加合物）、工艺相关杂质、Uny linker相关杂质等。所有未知或无法识别的杂质也归为Ⅳ类。

寡核苷酸杂质来源广泛，有些杂质来自核糖和骨架结构，有些则来自碱基。其中，以核糖和骨架结构为例，相关杂质如下表所示。

以碱基为例，相关杂质如下表所示。

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