Engineering (1区) I 抗癌老药“跨界”抗MRSA：5-FU靶向嘧啶代谢，显著增强磷霉素杀菌活性！(刘源团队—扬州大学)

2026年3月4日，扬州大学兽医学院刘源教授团队（扬州大学生物科学与技术学院教授、副院长，博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者（2022）。主要从事重要病原菌耐药性调控机制和干预控制的基础及应用基础研究，主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划课题、江苏省重点研发计划等科研项目）、江苏省重要动物疫病与人兽共患病防控协同创新中心、农业与农产品安全教育部联合国际研究实验室、扬州大学比较医学研究院等团队，在Engineering发表题为 “Boosting Fosfomycin Efficacy Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections by Targeting Pyrimidine Metabolism” 的研究论文。该文于2025年4月24日投稿，2025年12月7日修回，2026年1月5日接收，2026年3月4日在线发表。论文期刊信息显示，Engineering 为中国工程院院刊，由中国工程院主管，中国工程院战略咨询中心和高等教育出版社主办，并由 Elsevier 出版；LetPub 显示该刊 2024–2025 最新影响因子为 11.6，WOS 分区为 Q1。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是全球公共卫生领域的重要耐药病原体。传统治疗高度依赖抗菌药物，但 MRSA 传播快、耐药机制复杂，并与较高死亡率相关。论文指出，磷霉素（fosfomycin，FOS）因其独特作用机制，近年来重新受到关注；然而，FOS 单药治疗效果有限，如何通过联合用药恢复或增强其抗菌活性，是当前抗耐药感染研究的重要方向。

本研究发现，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的抗肿瘤药物 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU） 能够显著增强 FOS 对 MRSA 的抗菌作用。体外实验显示，5-FU 与 FOS 对多株 MRSA 表现出协同杀菌活性；在 MRSA T144 菌株中，两药联合的 FICI 为 0.375，联合处理 8 h 后，细菌负荷较单药或未处理对照显著下降 3–6 log10。此外，该组合还可减少 MRSA 生物膜形成，并降低成熟生物膜中的细菌负荷。

机制方面，研究团队通过转录组测序、耐药突变株单核苷酸多态性（SNP）分析、基因敲除和分子对接等实验，确定 CTP 合成酶 是 5-FU 的关键作用靶点。5-FU 靶向 CTP 合成酶后，可扰动细菌嘧啶代谢；而嘧啶代谢紊乱进一步引发细菌膜损伤、质子动力势（PMF）耗散、ATP 合成增强以及活性氧（ROS）累积，最终导致细菌死亡。尤其值得注意的是，敲除 pyrG 基因后，5-FU 与 FOS 的协同作用被消除，说明 CTP 合成酶及其相关嘧啶代谢通路是两药协同的关键环节。

在体内验证方面，研究者进一步采用大蜡螟感染模型和小鼠腹膜炎感染模型评估联合治疗效果。结果显示，5-FU 与 FOS 联合治疗显著提高感染宿主的生存率，并降低心、肝、脾、肺、肾等器官中的细菌负荷。研究同时对 40 mg/kg 5-FU 的安全性进行了初步评估，在实验观察期内未发现明显宿主毒性。

总体来看，该研究提出了一种“抗生素 + 非抗生素辅助药物”的抗 MRSA 思路：利用 5-FU 扰动 MRSA 嘧啶代谢，从代谢层面削弱细菌耐受状态，并显著增强 FOS 的抗菌效果。该发现不仅拓展了 5-FU 这一经典抗肿瘤药物在抗感染领域的潜在应用，也提示靶向细菌代谢通路可能成为恢复抗生素敏感性的重要策略。需要强调的是，该研究主要基于体外实验和动物感染模型，仍不能直接等同于人体临床疗效，后续还需进一步开展药代动力学、安全性和临床转化研究。

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【摘要】

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是全球公共卫生领域面临的重要威胁。联合治疗，尤其是抗生素与非抗生素类药物的联合应用，已成为应对抗生素耐药性危机的一种有前景策略。磷霉素（fosfomycin，FOS）目前越来越多地用于耐药细菌感染治疗，但单药应用时疗效有限。

本研究发现，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的抗肿瘤药物 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）能够有效增强 FOS 对 MRSA 的抗菌活性，包括对生物膜内 MRSA 细胞的作用。机制上，5-FU 靶向胞苷三磷酸（cytidine triphosphate，CTP）合成酶，该酶是催化尿苷三磷酸（uridine triphosphate，UTP）在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）依赖条件下转化为 CTP 的限速酶。

进一步研究表明，5-FU 与 FOS 的协同作用源于对嘧啶代谢的扰动。这种代谢扰动可诱导细菌膜损伤、质子动力势（proton motive force，PMF）耗散、ATP 合成增强以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）累积，最终导致细菌死亡。在大蜡螟（Galleria mellonella）和小鼠感染模型中，5-FU 与 FOS 联合用药显著提高了宿主生存率，并降低了细菌负荷。总体而言，本研究证明了 5-FU 联合 FOS 应对 MRSA 感染的治疗潜力，并强调了扰动嘧啶代谢在恢复抗生素敏感性中的关键作用。

01

研究背景及科学问题

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是一种革兰阳性病原菌，是医院获得性感染和社区获得性感染的重要病因之一，可造成严重临床后果。令人担忧的是，该菌已经对多类抗生素产生耐药性。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是典型代表，其最早于 20 世纪 60 年代初在临床中被发现。MRSA 菌株在全球范围内快速传播，对公共卫生安全构成严峻威胁。

目前，MRSA 是导致危及生命甚至致死性感染的重要病原体之一。传统 MRSA 治疗高度依赖抗菌药物，但抗生素的广泛使用推动了 MRSA 多重耐药性的形成。临床 MRSA 感染传播速度快、耐药机制复杂，并与较高死亡率相关。在欧盟，每年报告的 MRSA 感染接近 15 万例，导致超过 7000 例死亡。在中国，根据中国细菌耐药监测网（CHINET）的监测数据，过去五年 MRSA 感染率一直保持在 30% 以上。

尽管新型抗菌药物研发投入巨大，但近几十年获批的新抗生素数量有限，因此亟需发展新的抗感染策略。药物联合应用，特别是抗生素与辅助药物的组合，是一种有前景且成本相对可控的策略，有助于突破新药发现停滞局面，并使耐药细菌重新对抗生素敏感。抗生素与辅助药物联用不仅可以增强抗生素疗效，还可能延长现有抗生素的使用寿命，延缓耐药菌株的出现。此外，协同治疗还可能降低抗生素毒性、缩短治疗时间并减少用药剂量。

在耐药性日益严峻的背景下，一些老抗生素重新受到关注，例如多黏菌素和磷霉素（FOS）。FOS 于 40 多年前被发现，是一种强效杀菌药物，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均具有活性，包括多重耐药菌株。由于其独特的化学结构和作用机制，FOS 在 β-内酰胺类抗生素作用之前的阶段抑制肽聚糖合成，因此与其他抗菌药物发生交叉耐药的可能性较低。基于这些特点，FOS 被认为是治疗系统性感染的潜在候选药物。然而，尽管其临床应用逐渐增加，FOS 在联合治疗中的使用仍然较少，这一方向值得进一步探索，以充分发挥其治疗潜力。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种 FDA 批准的抗肿瘤药物，主要通过抑制脱氧胸苷酸（deoxythymidine monophosphate，dTMP）合成发挥作用，而 dTMP 是 DNA 复制所必需的核苷酸。此外，涂覆 5-FU 的中心静脉导管被认为是氯己定和磺胺嘧啶银涂层导管的一种安全有效替代方案，尤其适用于危重患者。既往研究显示，5-FU 对大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）和猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）等病原体具有潜在抗菌作用，并可抑制 E. coli 生物膜形成、降低细菌毒力。还有研究表明，5-FU 能够逆转耐碳青霉烯革兰阴性病原菌对美罗培南的耐药性。然而，5-FU 是否能够增强 FOS 对 MRSA 的抗菌效力，此前尚未得到探索。

本研究证明，5-FU 可在体外和体内有效增强 FOS 对 MRSA 的作用。通过结合耐药突变株的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析和基因敲除实验，研究者鉴定出 CTP 合成酶是 5-FU 的关键作用靶点。进一步的转录组分析揭示了 5-FU 与 FOS 协同作用的机制：嘧啶代谢扰动是两者协同的核心，可引发细菌膜损伤、PMF 耗散、ATP 合成增强以及氧化损伤增加，最终导致细菌死亡。这些发现提示，5-FU 与 FOS 联合应用具有治疗 MRSA 相关感染的潜在价值。

02

重要发现及亮点

5-FU 显著增强 FOS 对 MRSA 的抗菌活性

为筛选能够增强 FOS 对多重耐药革兰阳性菌作用的化合物，研究者检测了 FOS 与 30 种抗生素或非抗生素药物的协同活性，测试对象包括粪肠球菌（Enterococcus faecium）A4（VRE，VanA）、金黄色葡萄球菌 G16（RIFR）和 MRSA 1530。棋盘法实验显示，FOS 与多种化合物对 MRSA 表现出协同作用，其中包括利奈唑胺、莫西沙星和 5-FU。值得注意的是，5-FU 与 FOS 对 S. aureus G16 和 MRSA 1530 均表现出较强协同作用，FICI 分别为 0.3125 和 0.375，而在 E. faecium A4 中未观察到协同作用，提示该效应可能具有菌种特异性。进一步在临床相关 MRSA T144 菌株中验证，5-FU 也能增强 FOS 活性，FICI 为 0.375。

时间杀菌曲线显示，FOS 或 5-FU 单药对 MRSA T144 生长影响有限；而联合处理 8 h 后，与单药或未处理对照相比，细菌负荷显著下降 3–6 log10。流式细胞术检测也显示，联合处理后细菌存活率降至约 65%，而对照组和 FOS 单药组约为 98%，5-FU 单药组约为 80%。这些结果说明，5-FU 本身抗菌活性有限，但与 FOS 联用后可诱导明显的细菌死亡。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进一步观察细菌活/死状态。与 FOS 单药相比，联合处理组绿色荧光减少、红色荧光增加，提示细胞死亡增加。扫描电子显微镜（SEM）显示，对照组和单药组细菌表面规则完整；而 FOS 与 5-FU 联合处理后，细胞出现严重损伤，表面不规则并塌陷。透射电子显微镜（TEM）也证实，对照组和单药组细胞仍保持较光滑的圆形形态和完整细胞壁，而联合处理组细菌细胞壁和细胞膜完整性受损。

生物膜形成是 MRSA 感染中的重要毒力因素，可保护细菌抵抗抗菌治疗。研究者通过 CLSM 和结晶紫染色评估 FOS（1 μg/mL）、5-FU（16 μg/mL）及两者联合对生物膜的影响。结果显示，FOS 与 5-FU 联合显著减少生物膜形成；对于已经形成的成熟生物膜，联合处理也显著降低了生物膜内细菌负荷。这说明 5-FU 与 FOS 对 MRSA，包括生物膜包埋状态下的 MRSA 细胞，具有良好的协同抗菌活性。

图1：5-FU 增强 FOS 对 MRSA 的抗菌活性。（a）5-FU 与 FOS 抑制 S. aureus G16 和 MRSA 1530 生长的棋盘法实验。37 °C 孵育 18 h 后检测 OD600，并计算 FICI 值。协同作用：FICI ≤ 0.5；无相互作用：0.5 < FICI ≤ 4；拮抗作用：FICI > 4。实验进行了两次独立重复。（b）FOS 与 5-FU 对 MRSA T144 的协同活性，FICI 为 0.375。（c）5-FU 与 FOS 对 MRSA T144 的时间杀菌曲线。（d）5-FU 与 FOS 单独或联合处理 6 h 后，通过流式细胞术分析细菌活/死比例。活菌和死菌分别染成绿色和红色。LL：左下象限；UL：左上象限；LR：右下象限；UR：右上象限。（e）通过流式细胞术定量细菌存活率。（f）CLSM 分析 5-FU 与 FOS 单独或联合处理后的 MRSA T144；图中活菌为绿色，死菌为红色，标尺为 5 μm。（g）MRSA T144 经单药或联合处理 24 h 后，通过 SEM/TEM 观察的显微图像；SEM 图像标尺为 2 μm，TEM 图像标尺为 1 μm。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。P 值在（c）中通过非配对 t 检验确定，在（e）中通过单因素方差分析（ANOVA）确定。FOS（1）：FOS 浓度为 1 μg/mL；5-FU（16）：5-FU 浓度为 16 μg/mL。**P < 0.01，****P < 0.0001。

5-FU 靶向细菌 CTP 合成酶

为探索 5-FU 的作用机制，研究者对是否接受 5-FU 处理的 MRSA 细胞进行了 RNA 测序。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析显示，上调的差异表达基因主要与核糖体、同源重组、错配修复、DNA 复制、RNA 聚合酶和嘧啶代谢相关；而下调的差异表达基因则与 S. aureus 感染、阳离子抗菌肽（cationic antimicrobial peptide，CAMP）耐受、双组分系统、脂肪酸降解、磷壁酸生物合成和硫代谢相关。这些结果提示，5-FU 可能通过影响 DNA 合成，尤其是嘧啶代谢相关通路，发挥针对 S. aureus 相关感染的潜在作用。

为进一步寻找 5-FU 的潜在靶点，研究者将 MRSA T144 连续暴露于亚最低抑菌浓度（sub-MIC）的 5-FU 15 d。结果显示，5-FU 的 MIC 从 64 μg/mL 增加到 512 μg/mL，即升高 8 倍。与此同时，长期 5-FU 与 FOS 联合处理能够有效防止细菌对任一药物产生耐药。全基因组 SNP 分析发现多个基因出现突变，包括编码黏附素的 sdrC、编码 23S rRNA 甲基转移酶的 erm(C)、编码纤连蛋白结合蛋白的 fnbA/B、编码解离酶/整合酶的 bin，以及多个参与代谢过程的基因。基于这些发现，研究者重点关注了 CTP 合成酶，该酶由 pyrG 基因编码，参与核酸和磷脂生物合成。

为验证这一靶点，研究者在 S. aureus 中敲除了 pyrG 基因，并检测 MIC 的变化。与野生型（wild-type，WT）菌株相比，ΔpyrG 菌株对 5-FU 的 MIC 升高 2 倍。在 5-FU 存在条件下监测 WT 和 ΔpyrG 的生长曲线也显示，ΔpyrG 对 5-FU 具有更高耐受性，提示 CTP 合成酶可能是 5-FU 的潜在抗菌靶点。分子对接进一步显示，5-FU 可通过范德华力、氢键以及 Pi–Pi T 型相互作用，与 CTP 合成酶关键氨基酸残基结合，例如 GLU510、HIS508、VAL59 和 ARG461。

考虑到 CTP 合成酶在嘧啶代谢中的重要作用，研究者推测 5-FU 可能通过抑制 DNA 合成诱导细菌死亡。靶向代谢组学分析显示，经 5-FU 处理的 MRSA T144 细胞中，嘧啶代谢通路显著富集。尤其是 5-FU 处理后胸腺嘧啶水平显著下降，而外源性补充胸腺嘧啶可降低 5-FU 对 MRSA 的抑制作用。进一步通过补充 CTP 合成酶直接产物胞苷进行“救援实验”发现，胞苷补充使 5-FU 的 MIC 升高 2 倍，而 FOS 的 MIC 不变；棋盘法实验显示 FICI 从 0.375 升高至 0.5，提示协同作用减弱。这些结果表明，抑制 CTP 合成酶是 5-FU 抗菌活性及其增强 FOS 作用的关键因素，但并非唯一因素。

图2：5-FU 靶向细菌 CTP 合成酶。（a，b）联合处理组与对照组比较的 KEGG 通路富集分析。纵坐标表示显著富集通路。（c）MRSA T144 对 5-FU 的耐药性发展。（d）CTP 合成酶（pyrG）的 SNP 分析。（e）基因敲除流程示意图。蓝色箭头表示用于 PCR 验证编辑效率的引物，红色箭头表示用于测序的引物。（f）在 S. aureus RN4220 中通过 pCasSA 介导敲除 pyrG 基因。标记为“ck”的泳道为 WT 菌株 PCR 产物，用作对照。（g）突变菌株中 5-FU 的 MIC 变化。（h）在 64 或 128 μg/mL 5-FU 存在条件下，S. aureus RN4220 和 S. aureus RN4220-ΔpyrG 的生长曲线。（i）CTP 合成酶与 5-FU 的分子对接分析，二维图展示相互作用模式和结合位点。GLU：谷氨酸；HIS：组氨酸；ARG：精氨酸；PHE：苯丙氨酸；GLY：甘氨酸；PRO：脯氨酸；TYR：酪氨酸；ALA：丙氨酸；VAL：缬氨酸。数据以均值 ± SD 表示。P 值在（h、m、n）中通过非配对 t 检验确定。***P < 0.001，****P < 0.0001。

5-FU 与 FOS 联合扰动嘧啶代谢

为更深入理解 5-FU 与 FOS 的协同机制，研究者对 PBS、FOS 或 FOS 联合 5-FU 处理后的 MRSA 细胞进行了转录组分析。联合处理组与 PBS 组比较共鉴定出 1425 个差异表达基因，其中 730 个上调、695 个下调。聚类分析和 KEGG 分析显示，上调基因主要富集于核糖体、错配修复和嘧啶代谢通路；下调基因则涉及双组分系统和 ATP 结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters）。代表性基因的表达模式也支持这些通路受到影响。

此外，联合处理组与 FOS 单药组比较时，同样观察到嘧啶代谢通路上调。RT-qPCR 分析进一步证实，联合处理可增加嘧啶代谢通路相关基因表达，尤其是 pyrG 和 ndk 基因。这些结果提示，在联合治疗后，嘧啶代谢是 MRSA T144 中受到主要影响的通路。

为进一步确认联合处理对嘧啶生物合成的影响，研究者检测了二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）的变化。DHODH 是嘧啶合成中的关键酶，可催化二氢乳清酸（dihydroorotate，DHO）转化为乳清酸（orotate，ORO）。检测结果显示，5-FU 与 FOS 联合处理显著降低了细菌中 DHODH 水平，提示该组合扰乱了嘧啶生物合成。

考虑到嘧啶代谢对 DNA 合成和修复的重要性，研究者进一步检测了 8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）含量，以评估细菌 DNA 损伤。结果显示，联合处理显著升高细胞内 8-OHdG 水平，提示该组合可诱导明显的细菌 DNA 损伤。这些结果表明，5-FU 与 FOS 联合可扰动 MRSA 嘧啶代谢，并导致 DNA 损伤。

为验证嘧啶代谢扰动在 5-FU 与 FOS 协同抗菌中的作用，研究者敲除了 ndk 基因。该基因编码核苷二磷酸激酶，可促进核苷三磷酸向核苷二磷酸可逆转移 γ-磷酸。随后，研究者在 ΔpyrG 和 Δndk 两种突变株中检测 5-FU 与 FOS 的协同效应。结果显示，ndk 缺失轻度削弱了该组合的协同作用，而 pyrG 缺失则完全消除了两者的协同活性，说明 5-FU 对 CTP 合成酶的靶向作用是其增强 FOS 活性的必要条件。

图3：5-FU 与 FOS 联合扰动嘧啶代谢。（a）火山图显示差异表达基因（DEGs）的分布。下调和上调基因分别以蓝色和红色点表示。NoDiff：无差异。（b）选定 DEGs 的聚类热图。（c）KEGG 通路富集分析。纵坐标显示显著富集通路，表明嘧啶代谢、错配修复、双组分系统和 ABC 转运蛋白相关通路受到明显影响。（d）与上述 KEGG 通路相关的代表性基因表达模式。（e）单药组和联合组中 ndk 与 pyrG 基因的差异表达水平。（f，g）MRSA T144 经 5-FU、FOS 或两者联合处理后，（f）DHODH 和（g）8-OHdG 的水平。（h）比较 5-FU 联合 FOS 对三种 S. aureus（RN4220、RN4220-ΔpyrG 和 RN4220-Δndk）的协同作用。数据以均值 ± SD 表示。（e–g）中的 P 值通过单因素 ANOVA 确定。***P < 0.001，****P < 0.0001，ns：无统计学意义。

外源性嘧啶代谢物削弱 5-FU 与 FOS 的协同作用

鉴于 pyrG 和 ndk 在嘧啶代谢中的关键作用，研究者进一步评估外源性补充嘧啶代谢物，包括胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，是否会影响 5-FU 与 FOS 在 WT 及其突变株（ΔpyrG 和 Δndk）中的协同作用。棋盘法实验显示，在三种菌株中补充这些代谢物均可降低协同效应。与此一致，时间杀菌实验表明，嘧啶代谢物补充可削弱甚至消除 5-FU 与 FOS 的协同杀菌作用。总体来看，这些结果说明 5-FU 与 FOS 的协同抗菌活性高度依赖于嘧啶代谢通路的扰动。

图4：外源性嘧啶代谢物削弱 5-FU 与 FOS 的协同作用。（a）嘧啶代谢通路示意图。PRPP：磷酸核糖焦磷酸；UMP：尿苷一磷酸；UDP：尿苷二磷酸；UTP：尿苷三磷酸；dCMP：脱氧胞苷一磷酸；dCDP：脱氧胞苷二磷酸；dCTP：脱氧胞苷三磷酸；dUMP：脱氧尿苷一磷酸；dUDP：脱氧尿苷二磷酸；dUTP：脱氧尿苷三磷酸；dTDP：脱氧胸苷二磷酸；dTTP：脱氧胸苷三磷酸。（b–d）加入胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶后，5-FU 与 FOS 联合对（b）S. aureus RN4220、（c）S. aureus RN4220-Δndk 和（d）S. aureus RN4220-ΔpyrG 的协同抗菌作用，以及对应 CFU 变化。（e）补充嘧啶代谢物后 5-FU 与 FOS 的时间杀菌曲线。数据以均值 ± SD 表示。P 值通过非配对 t 检验确定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns：无统计学意义。

5-FU 与 FOS 联合诱导膜功能障碍和氧化损伤

接下来，研究者进一步探索 5-FU 与 FOS 联合最终导致细菌死亡的过程。首先，研究者使用碘化丙啶（propidium iodide，PI）评估 MRSA T144 的膜通透性。PI 是一种红色荧光染料，通常只能进入死亡或受损细胞。与 FOS 或 5-FU 单药相比，联合处理显著增强荧光强度，说明膜通透性增加。蛋白泄漏实验也证实，与单药或对照组相比，联合处理造成更明显的膜损伤。

细菌 PMF 由电子传递链活动产生，对细菌存活至关重要。研究者使用 DiSC3(5) 探针评估联合处理对 PMF 的影响。该探针会根据 PMF 中的膜电位（ΔΨ）成分在细胞质膜中积累；当 ΔΨ 被破坏时，探针释放至细胞外环境，导致荧光增强。结果显示，与单药相比，5-FU 与 FOS 联合处理引起更强荧光信号，说明联合用药加剧了 PMF 耗散。同时，研究者使用 BCECF-AM 荧光探针检测跨膜质子梯度（ΔpH），发现联合处理导致 ΔpH 增加，与 ΔΨ 耗散结果一致，反映出两者存在互补机制。

转录组证据提示，联合处理会干扰能量代谢。进一步检测显示，联合处理降低了 NAD+/NADH 比值，同时升高了 MRSA T144 细胞内 ATP 水平。PMF 耗散与 ATP 生成增加看似矛盾，因此研究者进一步开展转录组和 RT-qPCR 分析，发现氧化磷酸化相关基因（如 atpA/C/D/F/G）和脂肪酸生物合成基因（accA/B/C）上调，提示细菌可能通过增强呼吸活性来补偿能量和膜完整性损伤。此外，L-乳酸水平升高提示底物水平磷酸化增强，可能作为快速供能的替代途径。使用糖酵解抑制剂 2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）后，ATP 水平显著下降，说明在 5-FU 与 FOS 联合处理下，糖酵解成为主要 ATP 生成途径。

NAD+/NADH 比值失衡可触发 ROS 产生。研究者使用 DCFH-DA 荧光探针发现，5-FU 与 FOS 联合显著提高细胞内 ROS 水平。相反，加入 ROS 清除剂 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）可剂量依赖性减轻 5-FU 诱导的 ROS 升高，并消除 5-FU 与 FOS 的协同作用。高浓度 NAC（10 mmol/L）还可使 FOS 和 5-FU 的 MIC 均升高 2 倍，但 NAC 不影响 FOS 与利奈唑胺或莫西沙星的协同作用。这些结果提示，ROS 生成对 5-FU 与 FOS 的协同活性至关重要。

为进一步探索 CTP 合成酶抑制与 ROS 产生之间的联系，研究者检测了 ΔpyrG 菌株的 ROS 水平。与 WT 菌株相比，pyrG 缺失显著增加 ROS 生成，说明 5-FU 介导的 CTP 合成酶抑制会加重细菌氧化损伤。相反，加入 NAC 可显著降低 ΔpyrG 菌株中的 ROS 水平，进一步强调了嘧啶代谢在调控 ROS 累积中的作用。整体机制研究表明，5-FU 与 FOS 联合可扰乱细菌嘧啶代谢，并进一步引起膜损伤、ATP 合成增加和 ROS 生成，最终导致细菌死亡。

图5：5-FU 与 FOS 联合耗散 PMF 并加剧氧化损伤。（a）5-FU 与 FOS 联合处理后，MRSA T144 的膜通透性发生改变；（b）膜电位也发生变化。（c）5-FU 与 FOS 联合对 MRSA T144 中 ΔpH 的影响。（d）MRSA T144 经 5-FU 和 FOS 单独或联合处理后的 NAD+/NADH 比值。（e）MRSA T144 在不同处理条件下的细胞内 ATP 水平，通过监测相应发光信号进行测定。（f）检测 MRSA T144 细胞内 ROS 生成。（g，h）通过棋盘法实验和时间杀菌曲线评估外源性加入 NAC（2.5、5 和 10 mmol/L）对两者协同效应的影响。数据以均值 ± SD 表示。（a–e）中的 P 值通过单因素 ANOVA 确定，（h）中的 P 值通过 t 检验确定。*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns：无统计学意义。

图6：5-FU 与 FOS 联合抗 MRSA 的协同机制示意图。5-FU 与 FOS 联合扰动细菌嘧啶代谢，导致膜损伤、PMF 耗散、ATP 和 ROS 产生升高，最终引起细菌死亡。NCS1：神经元钙传感器 1；GlpT：糖脂转运蛋白；UhpT：糖磷酸转运蛋白。

5-FU 与 FOS 联合在体内感染模型中显示抗感染效果

鉴于 5-FU 与 FOS 在体外对 MRSA 表现出明显协同作用，研究者进一步在两种动物感染模型中评估其体内效果。在正式感染实验前，研究者首先评估了 5-FU 的安全性，以确保给药剂量不会引发潜在毒性。研究者向大蜡螟和小鼠给予 40 mg/kg 5-FU。在 7 d 观察期内，PBS 对照组和 5-FU 处理组个体均存活。5-FU 处理小鼠体重正常增长。进一步对血清生化指标以及肝、肾组织病理切片进行分析，使用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色，结果显示 PBS 组和 5-FU 组之间无显著差异，提示 40 mg/kg 5-FU 在真核宿主中未诱导可检测毒性。这些结果说明，后续体内感染模型结果不太可能受到 5-FU 宿主毒性的干扰。

随后，研究者在大蜡螟和小鼠感染模型中评估 5-FU 与 FOS 联合用药效果。在大蜡螟感染模型中，MRSA T144 感染后 PBS 处理组幼虫在 48 h 内全部死亡；单药处理组 5 d 后存活率仅为 37.5%。相比之下，联合处理组存活率达到 100%（P < 0.0001）。在小鼠腹膜炎感染模型中，FOS 与 5-FU 联合组相比单药组也显示出生存获益（P = 0.0071）。对小鼠器官中的细菌负荷进行检测发现，与单药组相比，联合处理组心、肝、脾、肺和肾中的 CFU 下降 2–3 log10。这些结果表明，5-FU 与 FOS 联合在 MRSA 相关感染动物模型中具有体内有效性。

图7：5-FU 与 FOS 联合的体内效果。（a）大蜡螟和小鼠腹膜炎-脓毒症感染模型的实验设计示意图。（b，c）感染 MRSA T144 并接受 5-FU 与 FOS 联合处理后，（b）大蜡螟幼虫和（c）小鼠的生存曲线（每组 n = 8）。P 值通过双侧 log-rank（Mantel-Cox）检验确定。（d）接受不同治疗方案后，MRSA 感染小鼠心、肝、脾、肺和肾中的细菌负荷（每组 n = 6）。数据以调整后的 P 值表示，并通过双因素 ANOVA 结合 Sidak 多重比较检验确定。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

【贡献】★★★★★

本研究表明，EgE 可通过激活 IRE1α/XBP1s 信号轴，纠正肝脏糖脂代谢紊乱，从而在 HFD 和 MCD 诱导的 MASLD 小鼠模型中改善疾病表型。其主要成分 MA 是首个经验证能够结合 IRE1α h1 口袋的配体。这些发现强调了激活 IRE1α/XBP1s 轴在不同病理背景 MASLD 中的治疗潜力，也提示蓝桉果实提取物有望成为 MASLD 干预的植物来源候选物。

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