《CEJ》免疫调控水凝胶修复放射性皮炎和辐射防护

今天分享一篇在著名期刊Chemical Engineering Journal上发表“Immunomodulatory hydrogel patches loaded with curcumin and tannic acid assembled nanoparticles for radiation dermatitis repair and radioprotection”的研究论文。

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放射性皮炎是放疗最主要的不良反应之一，是一类与活性氧（ROS）生成相关的皮肤损伤。研发兼具优异活性氧清除能力与生物安全性的功能化贴剂，对放射性皮炎的修复至关重要。本文构建了一种由天然来源物质组成的纳米杂化水凝胶贴剂，该贴剂同时具备化学清除活性氧与物理吸收辐射双重功能，可有效减轻辐射损伤。通过单宁酸（TA）与铁离子（Fe³⁺）自发配位，合成了包裹姜黄素（Cur）的姜黄素@单宁酸（Cur@TA）纳米颗粒，再将其载入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶贴剂中，赋予水凝胶组织黏附性与光热性能。该贴剂同时展现出强效的活性氧清除能力，并可促进巨噬细胞向M2型极化。此外，GelMA水凝胶的高含水量可物理吸收低能X射线，发挥辐射屏蔽作用。基于上述特性，本研究在放射性皮炎小鼠模型中证实了负载Cur@TA纳米颗粒的水凝胶贴剂具有增强的治疗效果。本研究为辐射防护与治疗提供了一种新型治疗策略，具有潜在的临床应用价值。

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放射性皮炎是放射治疗中普遍存在的不良反应，困扰着大量肿瘤患者，也带来了棘手的临床难题。电离辐射诱发活性氧（ROS）大量累积，进而引发一系列损伤，是放射性皮炎发生的主要机制之一。针对这一问题，研究者已开发出可化学清除细胞内活性氧的小分子药物，如氨磷汀、抗坏血酸等。尤其将活性氧清除剂负载于水凝胶基质后，其高保湿环境、可调控的力学性能与控释能力可进一步提升治疗效果。例如，Yu等人报道负载氨磷汀的透明质酸微针可通过药物长效释放，实现造血系统免受电离辐射损伤的长期保护。Hao等人报道一种仿生抗氧化类肝素肽水凝胶，可缓解辐射所致皮肤损伤的炎症浸润，同时促进血管生成与创面愈合。类似地，Zhang等人报道一种包含金纳米棒与没食子酸的生物黏附材料，可利用光热治疗与活性氧清除增强放射性皮肤损伤的治疗效果。

尽管已取得诸多进展，但小分子药物仍存在稳定性差、潜在副作用等问题。此外，损伤部位免疫微环境的改变对修复过程的影响也需纳入考量。同时，水凝胶贴剂在保湿性与皮肤有效黏附之间的平衡仍是一项挑战。因此，我们设想通过构建整合多种组分的杂化水凝胶贴剂，实现高效清除活性氧、调控局部免疫微环境、增强组织黏附的一体化系统，最终为辐射损伤提供修复治疗。

本文设计了一种负载姜黄素（Cur）与单宁酸（TA）组装纳米颗粒的黏附型水凝胶贴剂，用于放射性皮炎防护（图1）。姜黄素是源自姜黄的天然化合物，是一种具有明确抗氧化与抗炎功效的多酚。同样，作为植物来源的天然多酚，单宁酸不仅可清除自由基以减轻氧化应激损伤，还含有没食子酰基结构，可有效增强界面黏附。此外，单宁酸具有免疫与炎症调控作用，在组织修复领域极具前景。作为天然物质，姜黄素与单宁酸在获取简便性与可持续性上优于合成小分子药物。此外，单宁酸与Fe³⁺的配位复合物展现出良好的光热性能，可促进组织修复。因此，我们设想通过整合这些成分构建杂化水凝胶贴剂，实现有效的组织黏附与辐射损伤修复。

本文制备了负载姜黄素单宁酸组装纳米颗粒（Cur@TA）的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶贴剂。该纳米复合物通过单宁酸与Fe³⁺自发配位包裹姜黄素纳米颗粒合成，以解决游离姜黄素水溶性差、生物利用度有限的问题。将纳米颗粒载入GelMA水凝胶贴剂中，GelMA与细胞外基质结构相似，具有优异的生物相容性。水凝胶的三维网络可支撑纳米颗粒长效释放，发挥增强的抗氧化与免疫炎症调控功能，促进巨噬细胞向M2型极化。此外，由于高含水量，水凝胶基质可有效吸收辐射，形成良好的物理屏障。同时，纳米杂化水凝胶贴剂（Cur@TAGel）因单宁酸Fe³⁺配位复合物而具备光热性能，在近红外（NIR）照射下可有效增强活性氧（ROS）的抗氧化清除效率。基于这些优势，本研究在体外与体内放射性皮炎模型中证实，Cur@TAGel水凝胶贴剂具有显著的活性氧清除与辐射吸收能力。这种整合纳米颗粒的水凝胶贴剂在辐射防护与皮炎治疗中具有实用价值。

典型实验中，单宁酸与Fe³⁺在稀释形成的姜黄素纳米颗粒表面组装，形成亲水性Cur@TA纳米颗粒。如图2a所示，扫描电镜（SEM）图像显示纳米颗粒呈较为规整的纳米球形态。随后将纳米颗粒悬浮于GelMA预聚液中，加入LAP后紫外光聚合。为证实单宁酸与Fe³⁺在Cur@TA纳米颗粒形成过程中的相互作用，进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）测试。图S1显示，单宁酸光谱中1300–1000cm⁻¹区域主要与醇、醚、酯的C-O键振动相关。与Fe³⁺配位后，1308、1178、1014cm⁻¹处振动峰强度减弱，与Fe³⁺和单宁酸中酚羟基的相互作用相关。同时，874cm⁻¹处O-H面外弯曲振动减弱。此外，姜黄素在1629cm⁻¹处出现C=O、1024cm⁻¹处出现C-O-C振动峰，这些特征峰同样出现在Cur@TA纳米颗粒与Cur@TAGel水凝胶光谱中，证实纳米颗粒中含有姜黄素。上述结果证实Cur@TA纳米颗粒合成成功。进一步通过调整Cur@TA纳米颗粒浓度，制备一系列杂化水凝胶（图2b）。SEM图像证实纳米颗粒存在于水凝胶基质中（图2c、d）。

水凝胶具有亲水性三维网络结构，可吸收外界液体。因此溶胀实验可在一定程度反映水凝胶吸收组织渗出液的能力。考察Cur@TAGel水凝胶在PBS中的溶胀行为，结果显示水凝胶吸水膨胀，3h内达到溶胀平衡（图2e），证实其可吸附组织渗出液，维持创面清爽环境。随后对比Cur@TAGel水凝胶在37℃不同条件下的降解行为。如图2f所示，Cur@TAGel水凝胶在胶原酶存在下降解迅速，3天内几乎完全降解；而在PBS溶液中降解相对缓慢，第25天剩余质量率为30.93%。

随后研究姜黄素在水凝胶中的包封与释放。如图S2所示，姜黄素在乙酸乙酯（EA）中的吸收峰位于417nm。由于单宁酸与Fe³⁺稳定的螯合配位对复合纳米颗粒合成至关重要，本研究根据前期工作选择单宁酸、Fe³⁺、姜黄素摩尔比为1:2:8的纳米颗粒，对应的姜黄素载药量（DLC）约为43.91%，纳米颗粒包封率为54.89%。进一步研究姜黄素从Cur@TAGel水凝胶中的体外释放曲线，如图2g所示，前12h姜黄素快速释放，24h后逐渐减缓，72h后释放曲线进入平台期。上述结果表明姜黄素呈现长效释放特征，有利于药物发挥长期效果。此外，药物释放过程中各阶段释放速率与水凝胶微观结构、环境温度、pH等相关，这些因素将在未来研究中进一步探讨。

已有研究表明，水在低能辐射范围（30–80kV）内具有高衰减系数。由于低能X射线吸收是造成皮肤损伤的重要原因，采用显微CT评估Cur@TAGel水凝胶的屏蔽与吸收能力。如图2h所示，GelMA水凝胶与Cur@TAGel水凝胶的CT值均显著高于水，且Cur@TA纳米颗粒的存在进一步提高水凝胶密度，使Cur@TAGel水凝胶CT值更高。上述结果表明Cur@TAGel水凝胶对低能X射线具有高吸收能力，可提供一定物理防护。

随后考察Cur@TAGel水凝胶的组织黏附性能。单宁酸作为多酚化合物，含有多个酚羟基，可与其他分子形成氢键，展现优异黏附性能。为证实Cur@TAGel水凝胶的黏附性能，在猪皮上进行实验，模拟人体皮肤表面。如图3a所示，Cur@TAGel水凝胶可良好适配各种皮肤形变，展现出可拉伸性与黏附性，证实其有效黏附能力。

单宁酸与Fe³⁺的配位作用在近红外光谱区具有显著吸收，使Cur@TA纳米颗粒展现优异光热性能。随后考察不同混合比例（GelMA与Cur@TA纳米颗粒质量比100:1、150:1、200:1）与不同近红外强度（1、1.5、2W/cm²）下Cur@TAGel水凝胶的光热特性。用808nm激光照射含不同浓度Cur@TA纳米颗粒的凝胶10min，结果显示，初始3min主要升温阶段，100:1组平均升温速率达7.7℃/min，几乎是GelMA水凝胶（1.3℃/min）的6倍。此外，随着水凝胶中Cur@TA纳米颗粒浓度增加，200:1、150:1、100:1组最终温度分别升至45.6℃、46.6℃、53.0℃，而GelMA水凝胶温度无明显变化。上述结果表明Cur@TAGel水凝胶具有优异光热性能，且依赖于Cur@TA纳米颗粒浓度（图3b、图S3a）。此外，同一样品的光热效应随功率增加而增强（图3c、图S3b）。42℃热刺激已被证实可上调血管内皮生长因子（VEGF）、促进新生血管形成，进而加速创面愈合。但过高近红外照射功率可能导致组织损伤，因此选择1.5W/cm²作为适宜功率，该条件下凝胶贴剂（GelMA与Cur@TA纳米颗粒质量比100:1）温度可在5min内温和升至42℃，为创面提供充足温度缓冲。

已有研究表明单宁酸与姜黄素具有强效抗氧化作用。采用DPPH法评估Cur@TA纳米颗粒的自由基清除能力，如图3d所示，随着Cur@TA纳米颗粒浓度增加，DPPH・在531nm处的吸收逐渐降低，证实纳米颗粒具有显著自由基清除效果。此外发现，在近红外刺激维持溶液42℃条件下，同等剂量（25μg/mL）Cur@TA纳米颗粒的DPPH・清除效果显著增强（图3e）。同时验证ABTS自由基清除效果，Cur@TA纳米颗粒存在时ABTS⁺・被快速清除，表现为731nm处吸收峰下降（图3f）。同样，近红外照射下清除能力增强（图3g）。除清除上述两种氮自由基外，还考察Cur@TA纳米颗粒对氧自由基的清除能力，因氧自由基生成是放疗过程中诱发皮肤损伤的典型原因。体外通过Fenton反应模拟・OH生成，加入TMB后溶液逐渐变蓝，同时发现・OH含量随Cur@TA纳米颗粒加入逐渐降低（图3h），且近红外照射下清除效果进一步增强（图3i）。综上，Cur@TA纳米颗粒具有广谱自由基清除与抗氧化活性，近红外照射产生的热效应可加快自由基清除反应速率，提高清除效率。

细胞实验中，采用水凝胶24h浸提液处理细胞，分为GelMA组、Cur@TAGel组、Cur@TAGel+NIR组，通过计算凝胶在培养基中的质量浓度标注浸提液浓度。为研究水凝胶贴剂的生物相容性，采用CCK-8与活/死染色法进行细胞毒性评估。将HaCaT细胞与3T3细胞在不同浓度Cur@TAGel浸提液中培养3天，如图S4a–d所示，当浸提液浓度不高于0.1g/mL时，两种细胞在培养24、48、72h后均维持存活。随后评估Cur@TAGel水凝胶的血液相容性，结果显示该材料在不同处理条件下溶血率均低于1%（图S4e），证实Cur@TAGel水凝胶具有良好生物相容性。此外，普鲁士蓝染色结果表明Cur@TA纳米颗粒可被细胞摄取（图S5）。

鉴于姜黄素具有促进新生血管形成的作用，评估Cur@TAGel水凝胶的血管生成能力。如图4a所示，与其他组相比，Cur@TAGel组HUVECs连接更密集、管状结构更多。此外发现，温和近红外照射（维持温度42℃）可增强血管生成（图4b），这可能归因于热刺激可增强热休克蛋白90（HSP90）表达及相关通路。进一步通过划痕实验考察Cur@TAGel浸提液是否促进细胞迁移，如图4c、d所示，Cur@TAGel组在24h内创面愈合能力显著加快，这可能源于姜黄素促进细胞迁移的作用。

已有研究报道单宁酸具有免疫调控作用，可调控巨噬细胞向M2型极化。为证实Cur@TAGel水凝胶的免疫调控能力，先用LPS激活RAW264.7巨噬细胞，再用Cur@TAGel浸提液处理。免疫荧光染色检测各组所有巨噬细胞免疫标志物CD68与M2型巨噬细胞标志物CD206的表达。如图4e、f所示，Cur@TAGel组与Cur@TAGel+NIR组CD206表达均显著升高。有效调控巨噬细胞M2型极化，可优化放射性皮肤损伤部位的免疫微环境，通过抑制局部炎症加速放射性皮炎修复进程。

为系统评估Cur@TAGel浸提液对HaCaT细胞的辐射防护效果，采用DCFH-DA探针检测X射线照射后细胞内活性氧清除情况。与对照组相比，X射线组HaCaT细胞中DCF荧光信号显著增强，表明细胞内大量生成ROS（图5a）。同时用Cur@TAGel浸提液处理细胞后，荧光信号显著减弱，表明Cur@TAGel浸提液可有效清除细胞内ROS。此外，采用γ-H2AX探针可视化不同处理后的DNA损伤，如图5b所示，X射线照射后细胞产生强烈绿色荧光，表明DNA损伤明显；而X射线+Cur@TAGel组（X射线与Cur@TAGel浸提液共同处理）荧光强度显著降低。此外，为验证细胞长期存活水平，对HaCaT细胞进行克隆实验，如图5c、d所示，Cur@TAGel浸提液处理有效减轻X射线诱导的细胞损伤，证实Cur@TAGel浸提液具有长期辐射防护效果。

鉴于Cur@TAGel水凝胶在体外具有良好辐射防护性能，进一步评估其体内防护能力。首先通过小鼠组织病理切片与血液相关检测考察Cur@TAGel水凝胶的体内安全性，如图S6所示，水凝胶对主要脏器无明显病理损伤，血常规与血液生化指标无明显异常。在此基础上，继续评估Cur@TAGel水凝胶的体内皮肤辐射修复效果，并与透明质酸钠对比疗效。在昆明小鼠右后腿构建急性放射性皮肤损伤模型，照射14天后，小鼠皮肤出现典型红斑、脱皮、水肿。将此日记为第0天，将小鼠分为四组：X射线组、X射线+SH组、X射线+Cur@TAGel组、X射线+Cur@TAGel+NIR组。每两天更换一次凝胶敷料，X射线+Cur@TAGel+NIR组每日接受近红外照射，小鼠热图像如图S7所示。图6a显示不同处理后皮肤创面变化，第7天X射线组创面无修复迹象且加重，而X射线+Cur@TAGel组症状缓解、皮肤创面明显愈合。第14天，X射线+Cur@TAGel组与X射线+Cur@TAGel+NIR组均出现毛发生长趋势，而另外两组创面渗出虽减少但仍处于损伤状态。第21天，X射线+Cur@TAGel组与X射线+Cur@TAGel+NIR组创面被毛发覆盖，治疗效果显著优于另外两组。根据RTOG毒性标准对小鼠不同阶段创面分级，如图6b所示，经21天治疗，Cur@TAGel水凝胶治疗两组皮炎分级显著低于另外两组。

此外，分别在第7天与第21天对皮肤创面组织进行病理分析。首先通过苏木精伊红（H&E）与Masson染色评估病理损伤（图6c）。X射线组皮肤损伤严重，表皮明显破损，胶原纤维排列紊乱；治疗21天后表皮增厚、角质层增厚、胶原纤维致密且排列不规则，皮肤附属器几乎无再生。相比之下，Cur@TAGel水凝胶治疗组在治疗后第一周即可有效抑制急性皮肤损伤。对比21天后各组情况，Cur@TAGel水凝胶治疗组皮肤完整性更高，新生毛囊数量显著增加，胶原纤维排列更接近正常组织，且近红外刺激可加速皮肤修复。综上，Cur@TAGel水凝胶在小鼠模型中对辐射诱导损伤具有显著修复效果。

进一步通过免疫组化分析IL-6与TNF-α表达水平。图7a–d显示，第7天X射线组与X射线+SH组出现大量IL-6与TNF-α染色，表明炎症严重；而X射线+Cur@TAGel组与X射线+Cur@TAGel+NIR组炎症程度较轻，表明Cur@TAGel水凝胶可抑制炎症、防止创面恶化。第21天各组炎症状态与上述趋势一致，表明Cur@TAGel水凝胶可缓解放射性皮炎炎症，助力皮肤恢复。

此外，采用CD206标记M2型巨噬细胞、CD68标记所有巨噬细胞亚群。如图7e、f所示，治疗7天后组织中，Cur@TAGel治疗组CD206阳性表达（红色荧光）更高，其中X射线+Cur@TAGel+NIR组CD206分布最广，表明巨噬细胞更多向M2型极化，证实创面向良好修复方向进展。同时通过血管内皮细胞标志物CD31与α-SMA评估新生血管情况，如图S8所示，21天后X射线+Cur@TAGel组与X射线+Cur@TAGel+NIR组CD31与α-SMA表达较X射线组与X射线+SH组显著升高，表明血管化程度更高。

鉴于Cur@TAGel水凝胶可有效物理屏蔽低能X射线，本研究进一步在上述模型中加入凝胶防护设计，以减轻放射性皮炎。通过H&E与Masson染色分析小鼠照射后创面情况，照射后第14天（第0天），与X射线组、X射线+SH组相比，X射线+Cur@TAGel组皮肤损伤显著减轻（图S9a）。病理染色分析显示，X射线组与X射线+SH组胶原纤维密度不均、皮肤附属器受损；而X射线+Cur@TAGel组皮肤附属器相对完整，胶原分布接近正常组织（图S9b）。上述研究为Cur@TAGel水凝胶在放射性皮炎治疗与预防中的良好治疗效果提供了有力证据。