Nature | 三级淋巴结构——肾癌抗肿瘤免疫中的“双面间谍”

撰文|咸姐

三级淋巴结构（TLS）是慢性炎症下在非淋巴组织中形成的异位淋巴聚集体，主要由T细胞、B细胞和抗原呈递细胞组成，并模拟了次级淋巴器官的部分功能。既往研究表明，成熟的TLS含有类似淋巴结的T细胞区和生发中心，并与更好的免疫治疗预后显著相关，然而，在肾细胞癌（RCC）这一具有高度免疫浸润特征的肿瘤类型中，约30%至40%的病例所携带的TLS往往以未成熟形式为主，即缺乏典型的滤泡树突状细胞和生发中心B细胞标志物，这使得其免疫功能更加难以捉摸。尤为矛盾的是，此前空间图谱研究揭示RCC中TLS富集了初始CD4+ T细胞和低扩增克隆，暗示其可能并非活跃的抗肿瘤免疫应答中心。与此同时，关于RCC浸润的肿瘤特异性T细胞的表型也存在争议：部分报道认为这些细胞以终末耗竭状态为主，而在黑色素瘤等高突变负荷肿瘤中，肿瘤特异性T细胞同时包含具有增殖和持久能力的祖细胞样耗竭亚群和终末分化的耗竭亚群，且前者与更好的临床结局相关【1-3】。虽然TLS已被证实与免疫检查点阻断疗法的良好应答密切相关，但RCC中上述表型差异是否源于TLS对T细胞分化轨迹的调控，TLS在肿瘤微环境（TME）中如何塑造肿瘤特异性T细胞的表型与功能，都尚不明确，成为亟待解答的问题。

近日，来自美国丹娜-法伯癌症研究所的Catherine J. Wu团队在Nature上在线发表题为Tertiary lymphoid structures harbour stem-like tumour-specific T cells的文章，通过单细胞转录组、TCR功能筛选和空间转录组等技术，系统解析了TLS对RCC中肿瘤浸润T细胞景观的全面影响，发现RCC中的TLS是富集肿瘤特异性T细胞的重要储库——这些T细胞虽处于耗竭状态，却保留了干细胞样祖细胞表型，具有更好的抗肿瘤潜力。然而，TLS阳性肿瘤边缘的免疫抑制性巨噬细胞会与这些T细胞共定位，形成免疫逃逸的“刹车”机制。研究揭示了TLS在抗肿瘤免疫中的双重角色，并为靶向TLS内干细胞样T细胞的免疫治疗策略提供了理论依据。

本文研究人员通过对24例初治RCC样本的组织学评估，发现其中12例存在TLS结构，且这些TLS绝大多数为不成熟型，缺乏滤泡树突状细胞和生发中心B细胞标志物。单细胞转录组测序分析显示，相较于TLS阴性肿瘤，TLS阳性肿瘤的免疫细胞中CD8 ⁺ 耗竭T细胞（T ex ）、干扰素刺激基因高表达的CD8 ⁺ T细胞、增殖性T细胞及凋亡性T细胞的比例均显著升高，且T ex 细胞浸润程度与TLS数量呈弱正相关。同时，TLS阳性肿瘤中B细胞和浆细胞标志物表达上调，而缺乏CD163表达的巨噬细胞、自然杀伤细胞及单核细胞则相对减少。配体-受体分析显示，TLS阳性肿瘤中T ex 细胞通过CXCL13-CXCR5轴与B细胞相互作用，并通过ACKR1、ITGA9-ITGB1等分子与肿瘤相关内皮细胞互作，提示TLS可能参与T细胞招募；而无论TLS状态如何，免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（CD163+ TAM）和单核细胞均通过LGALS9-HAVCR2、CD86-CTLA4等免疫抑制配体与T ex 细胞互作。这些结果表明，TLS阳性TME中的基质和免疫组分共同支持TLS形成及肿瘤特异性Tex细胞的募集，但髓系驱动的免疫抑制也同时存在。

随后，研究人员探究了TLS的存在可能对肿瘤特异性CD8 + 和CD4 + T细胞应答中的整体T细胞表型产生的影响。通过高分辨率单细胞测序发现，CD8 ⁺ T细胞可划分为记忆性（T mem ）和耗竭性（T ex ）两大区室，其中T ex 区室包含两个终末耗竭亚群（T ex -1、T ex -2）、一个祖细胞样耗竭亚群（T pex ）及两个增殖亚群。尽管CD4 ⁺ T细胞亚群在TLS状态间无显著差异，但所有五个T ex 亚群的耗竭特征评分在TLS阴性肿瘤中均显著高于TLS阳性肿瘤，尤以T ex -2亚群在TLS阴性肿瘤的CD8 ⁺ 肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中更为富集，该亚群高表达HAVCR2等终末耗竭标志物，提示其抗肿瘤活性可能受限。通过单细胞TCR追踪发现，同一TCR克隆主要局限于T ex 或T mem 区室之一，据此可将克隆类型分为T ex -TCR与T mem -TCR。T ex -TCR在肿瘤中的扩增程度远高于正常肾组织，且显著富集了肿瘤特异性基因特征，证实T ex 区室是RCC中推定肿瘤特异性T细胞的主要来源。值得注意的是，在T ex 克隆型内部，T pex 亚群表达了最高水平的祖细胞耗竭特征基因，且其在TLS阳性肿瘤中推定肿瘤特异性克隆内的占比显著高于TLS阴性肿瘤，提示TLS与肿瘤特异性T细胞维持干细胞样祖细胞状态之间存在关联。

为直接验证RCC浸润T细胞的肿瘤特异性，研究人员从3例TLS阳性和3例TLS阴性肿瘤中，选取554个扩增T细胞克隆（涵盖各表型区室）进行TCRα/β链重建与功能性筛选。在390个测试的CD8 ⁺ TCR克隆中，70个为肿瘤特异性TCR（TS-TCR），显著富集于T ex 区室；另有21个TCR（以T mem 表型为主）呈交叉反应。TLS阳性与阴性肿瘤间肿瘤反应性TCR比例无显著差异，且70.5%的T ex 区室扩增克隆未显示肿瘤反应性。此外，38个病毒特异性TCR（VS-TCR）富集于T mem 区室，印证了既往发现。132个CD4 ⁺ TCR克隆中仅鉴定出2个TS-TCR和4个VS-TCR，且后者无一属于T ex 表型。与此同时，尽管大多数TS-TCR缺乏已知的同源抗原，研究人员仍从一个患者中鉴定出11个TS-TCR识别单一免疫显性新抗原NSUN5.pQ18K，该新抗原特异性T细胞在肿瘤和转移灶中分别占CD8 ⁺ TIL的15.8%和25.5%。另有10个T ex 来源的TCR识别7种肿瘤相关抗原（TAA），如NAT8（被5个肿瘤中7个克隆识别），经功能验证确认NAT8为真实靶标，新抗原特异性TCR对突变肽的亲和力远高于野生型肽，且显著高于TAA特异性TCR。值得注意的是，在TLS阳性肿瘤中，肿瘤特异性TCR的T pex 细胞比例更高，表明TLS阳性肿瘤中更大比例的肿瘤特异性Tex细胞保留了干细胞样祖细胞特征。

进一步地，为直接探究TLS对TS-TCR分布与表型的影响，研究人员又对6例患者进行了空间转录组与TCR测序。结果显示，在TLS阴性肿瘤中，空间定位显示免疫呈弥漫性浸润而无明显淋巴聚集，而TLS阳性肿瘤则呈现清晰的T细胞-B细胞聚集，且其中2例肿瘤在肿瘤边界处形成了由髓系细胞密集构成的“髓系边界”，这些区域高表达免疫抑制性TAM转录特征，T ex 细胞TCR整体富集于TLS区域之外，反而与CD4 ⁺ T reg 细胞共同定位于髓系边界，而非TLS内部；仅有少数T ex 克隆在TLS内显著富集。蛋白水平验证发现，无论TLS状态如何，CD3 ⁺ T细胞在CD163 ⁺ 巨噬细胞附近密度更高。在60例独立验证队列中，TLS高密度肿瘤边界区CD163 ⁺ 巨噬细胞密度显著更高；其中10例的分析表明，终末耗竭CD8 ⁺ T细胞优先定位于边界区，且更频繁地出现在CD163 ⁺ 巨噬细胞附近。这些发现揭示巨噬细胞富集的边界区域是TLS阳性肿瘤中T ex 细胞与免疫抑制性髓系细胞相互作用的主要场所，与既往报道的巨噬细胞介导的RCC免疫抑制机制相符。

最后，研究人员对TLS阳性肿瘤中TCR的空间分布进行了精细解析，发现部分TCR克隆对特定TLS结构具有空间偏好性，且不同TLS可能呈现不同抗原谱。肿瘤特异性TCR附近可检测到免疫球蛋白和浆细胞转录本的高表达，但B细胞特异性特征不明显，且血浆细胞转录本在TLS区域最为富集，支持TLS内肿瘤特异性T细胞与B谱系细胞的共定位。配体-受体分析提示TLS通过抗原呈递、趋化及黏附信号促进T细胞招募。在同时存在于TLS内外的共享T ex 克隆中，TLS内细胞的T pex 表型评分高于TLS外，且TLS内T pex 细胞占比与单细胞测序中该克隆的T pex 比例相当；7个新抗原特异性TCR在TLS内以低频率检出，其T pex 占比与单细胞数据一致。这些共享克隆使得直接比较TLS定位对T细胞表型的影响成为可能。总体而言，尽管大多数扩增TCR位于TLS外，但共享克隆约占TCR库的25%，提示TLS虽然并非T ex 细胞的主要聚集地，却以低频率维持着肿瘤特异性T细胞的干细胞样表型，支持TLS作为T pex 肿瘤特异性T细胞的功能性储库的结论。

综上所述，本研究定义了RCC中的空间免疫结构，揭示了TLS在RCC中充当肿瘤特异性干细胞样祖细胞耗竭T细胞的功能性储库，为其维持抗肿瘤活性提供了适宜微环境；与此同时，肿瘤边界处髓系细胞驱动的免疫抑制则对抗有效的肿瘤浸润T细胞应答。这一双重发现为理解TLS在抗肿瘤免疫中的复杂角色提供了新视角，并为靶向TLS内干细胞样T细胞亚群以增强免疫治疗疗效奠定了理论基础。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10808-w

制版人： 十一

参考文献

1. Sautès-Fridman, C., Petitprez, F., Calderaro, J. & Fridman, W. H. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy.Nat. Rev. Cancer19, 307–325 (2019).

2. Xu, W. et al. Unveiling the impact of tertiary lymphoid structures on immunotherapeutic responses of clear cell renal cell carcinoma.MedComm5, e461 (2024).

3. Liu, S. et al. Spatial maps of T cell receptors and transcriptomes reveal distinct immune niches and interactions in the adaptive immune response.Immunity55, 1940–1952 (2022).

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