Nature | 焦亡通路上的“借道入胞”——GSDMD孔介导的caspase抑制剂靶向递送

撰文|咸姐

细胞死亡是多细胞生物发育、稳态维持和病原防御的核心环节，其中程序性细胞死亡主要分为细胞凋亡（apoptosis）和细胞焦亡（pyroptosis）两条通路，二者均由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族介导。炎性caspase（包括人源的caspase-1、-4、-5以及小鼠的caspase-1和-11）在炎症小体复合物中被激活，进而切割成孔蛋白Gasdermin D（GSDMD），释放其N端成孔结构域，在细胞膜上形成孔洞，引发细胞焦亡——一种裂解性、促炎性的细胞死亡方式，并伴随IL-1β和IL-18等炎症因子的大量释放。与此相对，凋亡则由caspase-8和-9启动，继而激活执行型caspase-3和-7，以非裂解方式清除细胞。尽管凋亡和焦亡在生理条件下发挥重要功能，但二者的过度激活均已被证明与多种炎症性疾病的发生发展密切相关【1】。因此，靶向caspase活性以抑制病理性细胞死亡，成为抗炎治疗的重要策略。然而，既往开发的细胞可渗透性广谱caspase抑制剂在临床试验中屡遭挫败，主要归因于毒性反应或疗效不足，部分原因在于广谱抑制会干扰caspase-8的功能，从而在某些细胞中诱发替代性坏死性凋亡（necroptosis）【2】。此外，由于caspase家族成员之间存在高度的结构同源性，开发高选择性的caspase抑制剂一直面临巨大挑战。近年来，有研究发现靶向GSDMD的细胞外纳米抗体在某些条件下可进入早期GSDMD孔并减少后续孔的形成，从而减轻焦亡性死亡【3】。这一现象提示，GSDMD孔可能在孔形成早期阶段允许某些大分子或通常无法穿透细胞膜的分子通过，这为设计新型选择性caspase抑制剂提供了新的思路。

基于以上，来自美国基因泰克公司的Vishva M. Dixit团队提出假设：若能开发出对炎性caspase具有选择性、且正常状态下无法穿透细胞膜的小分子抑制剂，那么这些抑制剂将仅在细胞启动焦亡、形成GSDMD孔后才进入靶细胞，从而实现“按需”抑制，避免广谱抑制正常细胞所带来的毒副作用。在这一背景下，该团队于近日在Nature杂志在线发表题为Gasdermin D-mediated delivery of caspase inhibitors to suppress pyroptosis的文章，系统设计并筛选了一系列四肽类共价抑制剂，旨在利用GSDMD孔作为药物进入的“通道”，实现对焦亡途径的选择性阻断，并通过体外和体内模型验证其疗效和机制。

本文研究人员首先利用杂交组合底物文库（HyCoSuL）系统筛查了人caspase-1、-4和-5的底物偏好，发现与小鼠caspase-1和-11类似，它们均偏好P2位组氨酸和P3位谷氨酸，但在P4位存在差异（caspase-11偏好小脂肪族残基，而caspase-1/4/5偏好大体积残基），且caspase-4与小鼠caspase-11虽功能相似但底物偏好不同。鉴于人caspase-1/4/5具有相似的切割偏好，研究人员又测试了先前报道的一组四肽caspase底物，发现含有人pro-IL-1β中Trp-Val-His-Asp序列的底物最易被人caspase-1切割，而含有GSDMD中Phe-Leu-Thr-Asp序列的底物效率约低三倍，且caspase-1的催化效率较其他炎性caspase高出一个数量级。此外，在四肽序列中引入非天然氨基酸既能提高切割效率，也能增强对促炎性caspase相对于促凋亡caspase的选择性。

根据caspase的切割位点偏好，研究人员合成了约100种含酰氧基甲基酮（AOMK）反应基团的四肽共价抑制剂，在重组人caspase上筛选出KGR-3、KGR-23和KGR-72为人caspase-1的有效选择性抑制剂，且能抑制小鼠caspase-1，但这些化合物在缺乏外排泵MDR1的gMDCKI细胞中的渗透性极低。为验证其能否经GSDMD孔进入细胞，研究人员又测试了它们对THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的NLRP3/caspase-1依赖性焦亡的抑制，发现多种四肽可显著减少细胞裂解。随后，利用表达FKBP-caspase-4或-11融合蛋白的THP-1细胞，通过可透过细胞的B/B配体二聚化引发焦亡，研究人员鉴定出若干种与广谱caspase抑制剂emricasan相当的化合物，例如KGR-3可阻断caspase-4诱导的死亡但对caspase-11效果较弱，而KGR-23、KGR-53和KGR-72则对二者均有抑制。为排除非GSDMD依赖的进入方式，研究人员还测试了这些化合物对星形孢菌素诱导的凋亡的影响，结果显示与emricasan不同，所选四肽均不能抑制凋亡。

进一步地，KGR-3作为有效的caspase-1和-4抑制剂被深入表征。实验结果显示，KGR-3在多种细胞体系中均能阻断焦亡和IL-1β分泌，包括THP-1 FKBP-caspase-4细胞、ATP刺激的PMA分化THP-1细胞以及VBP激活NLRP1炎症小体的Ker-CT细胞（后者依赖GSDMD和GSDME）。在EA.hy926细胞中，VBP通过CARD8-caspase-1炎症小体触发细胞死亡，KGR-3抑制GSDMD依赖性焦亡，但对caspase-1驱动的凋亡小泡和caspase-3切割无效，表明其需经GSDMD孔进入细胞；即使在VBP处理后数小时加入KGR-3，仍能阻止后续裂解和IL-1β释放，且细胞可继续生长，提示GSDMD孔形成后存在干预窗口。在表达FKBP-caspase-4的EA.hy926细胞中，KGR-3同样有效，而ESCRT蛋白VPS4A和CHMP3的显性负突变可抵消其保护。此外，由于在凋亡细胞中具有低渗透性，KGR-3不影响TRAIL诱导的外源性凋亡、MCL-1抑制剂S63845诱导的内源性凋亡以及李斯特菌溶血素O诱导的坏死。与此同时，通过检测膜不通透的荧光小分子PI和YOYO-1在GSDMD孔形成后的细胞摄取，研究人员证实了在caspase-1被KGR-3抑制的情况下，初始GSDMD孔仍会短暂开放，允许小分子进入活细胞胞质，且该过程严格依赖caspase-1和GSDMD；这为KGR-3等低通透性抑制剂通过GSDMD孔进入细胞提供了直接证据。不过，由于荧光标记KGR-3会损害其活性或选择性，直接观察抑制剂通过内源性Gasdermin孔的动态过程仍有待未来实现。

最后，鉴于caspase-11依赖性焦亡在LPS诱导的内毒素休克中起重要作用，研究人员对KGR-53进行了深入表征——该化合物对caspase-11的抑制效力强于KGR-3，但在LPS转染的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中仅能部分抑制焦亡。考虑到GSDMD孔道可能对带负电荷化合物的转运效率较低，研究人员去除KGR-53 P3位谷氨酸的负电荷，得到KGR-53P。优化后的KGR-53P作为低细胞通透性的caspase-1/11抑制剂，在体外能有效阻断LPS诱导的巨噬细胞焦亡、GSDMD切割及IL-1β/IL-18分泌，延迟给药仍有效，且不影响凋亡。在小鼠内毒素休克模型中，KGR-53P可显著降低血清IL-18和IL-1β水平，表明低通透性caspase抑制剂可通过GSDMD孔进入细胞并限制炎性因子的产生。不过，研究人员也观察到KGR-53P在无LPS情况下会升高血清肝酶水平，这可能属于工具化合物的脱靶效应，提示其仍需进一步优化。

上述结果综合表明，传统上因通透性差而被认为不适合药物开发的caspase抑制剂，可利用焦亡细胞特有的GSDMD孔作为“入口”实现靶向递送，从而在体内有效抑制炎症反应。本研究开发的低通透性但高选择性的caspase-1/4/11抑制剂（KGR-3和KGR-53P），实现了对焦亡和炎症因子释放的选择性阻断，而不影响正常细胞的凋亡。毫无疑问，这一策略为脓毒症、急性呼吸窘迫综合征和COVID-19等以过度炎症小体激活为特征的疾病提供了新的治疗思路。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10957-y

制版人： 十一

参考文献

1. Newton, K., Strasser, A., Kayagaki, N. & Dixit, V. M. Cell death.Cell187, 235–256 (2024).

2. Dhani, S., Zhao, Y. & Zhivotovsky, B. A long way to go: caspase inhibitors in clinical use.Cell Death Dis.12, 949 (2021).

3. Schiffelers, L. D. J. et al. Antagonistic nanobodies implicate mechanism of GSDMD pore formation and potential therapeutic application.Nat. Commun.15, 8266 (2024).

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