越来越卷了！Chinese Medicine:广州中医药大学揭示益气活血解毒方缓解脓毒症肺损伤的核心免疫机制~

【写在前面】：本期推荐的是由广州中医药大学第二临床医学院、广州中医药大学第二附属医院等研究团队合作近期发表于Chinese Medicine(IF7.4）的一篇文章，益气活血解毒方通过激活巨噬细胞PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，抑制mtDNA-STING炎症通路，从而减轻脓毒症相关急性肺损伤。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Yiqi Huoxue Jiedu formula protects against sepsis-associated lung injury by modulating macrophage mitophagy and mtDNA-STING signaling

研究背景：

脓毒症是感染引发的宿主免疫应答紊乱性致命疾病，脓毒症相关急性肺损伤（SALI）是其高发且危重的并发症，发生率高达 25%–45% ，是脓毒症患者的主要死亡诱因之一。目前临床以支持治疗为主，缺乏靶向性根治手段，存在显著治疗缺口。

巨噬细胞是SALI肺组织损伤的核心介导细胞。持续炎症刺激会导致巨噬细胞线粒体功能障碍：受损线粒体堆积引发活性氧（ROS）过量生成、线粒体DNA（mtDNA）外泄，进而激活cGAS-STING炎症通路，放大肺部炎症级联反应。

PINK1/Parkin介导的线粒体自噬可清除损伤线粒体、抑制mtDNA释放，是抑制肺部炎症、保护肺组织的关键机制。然而在SALI状态下，该通路被显著抑制，导致胞质mtDNA泄漏并持续激活cGAS-STING通路，加剧I型干扰素反应和炎症级联。

益气活血解毒方（YHJF）是基于中医 “正气亏虚、瘀毒互结” 病机研发的特色中药复方，由人参、三七、大黄组方而成，近二十年用于脓毒症辅助治疗。既往临床研究证实其可改善脓毒症患者器官功能评分、调节肠道菌群，但该方剂干预SALI的具体分子机制尚不明确。

研究目的：

本研究旨在明确益气活血解毒方（YHJF）在脓毒症相关急性肺损伤（SALI）中的保护机制，并验证 “巨噬细胞线粒体自噬/mtDNA-STING炎症轴” 作为YHJF治疗SALI的核心靶点。

研究方法：

1. 体内实验模型：

通过盲肠结扎穿刺法（CLP） 构建小鼠SALI模型

实验分组：Sham、CLP、YHJF低/中/高剂量组、地塞米松（DEX）阳性对照组

评估指标：组织病理学（HE染色）、micro-CT、肺功能评估、ELISA

2. 体外实验体系：

LPS刺激的MH-S巨噬细胞模型模拟巨噬细胞损伤

双向药理学调控：使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1和激活剂尿石素A（UA） 进行干预

巨噬细胞-上皮细胞共培养系统（MH-S + MLE-12）

3. 机制解析手段：

肺组织及巨噬细胞蛋白质组学分析（GO、Reactome、GSEA富集分析）

HPLC指纹图谱与UPLC-HRMS化学表征

分子对接预测活性成分与靶点结合

透射电镜（TEM）、免疫荧光共定位、Western blot、qRT-PCR

研究结果：

一、YHJF显著改善CLP诱导的SALI小鼠肺损伤

YHJF显著提高CLP诱导的SALI小鼠的7天存活率，并改善了肺损伤、肺水肿、呼吸功能障碍和全身炎症。HE染色显示YHJF明显减轻肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润等病理改变；micro-CT进一步证实YHJF对肺损伤的保护作用；肺功能评估显示YHJF显著改善呼吸频率、潮气量和肺顺应性。

二、YHJF通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬恢复巨噬细胞线粒体稳态

蛋白质组学分析和后续功能实验表明，巨噬细胞中线粒体自噬增强是其核心保护机制：

在体内，YHJF增加了支气管肺泡灌洗液（BALF）来源的肺泡巨噬细胞中自噬体形成和PINK1/Parkin共定位。

在体外，YHJF通过激活巨噬细胞中PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬恢复线粒体稳态——降低ROS积累、恢复ATP产生、维持线粒体膜电位。

三、YHJF抑制mtDNA-STING炎症通路

YHJF激活线粒体自噬后，伴随胞质mtDNA泄漏减少、cGAS表达下调以及STING–TBK1–IRF3通路和随后I型干扰素反应的抑制。

四、线粒体自噬是YHJF发挥保护作用的必要条件

用Mdivi-1药理学抑制线粒体自噬可消除YHJF的这些保护作用，而用UA激活则增强这些作用，证明线粒体自噬是YHJF介导保护所必需的。

五、YHJF通过调节巨噬细胞活性减轻肺泡上皮细胞损伤

在巨噬细胞-上皮细胞共培养系统中，YHJF处理的巨噬细胞减轻了LPS诱导的MLE-12肺泡上皮细胞凋亡。

六、鉴定出YHJF调控线粒体自噬的候选活性成分

化学分析结合分子对接鉴定出芦荟大黄素（aloe-emodin） 、大黄酸（rhein） 和染料木素（genistein） 是YHJF的候选生物活性成分，可能有助于其调控巨噬细胞线粒体自噬。

研究结论：

YHJF通过恢复巨噬细胞线粒体自噬并抑制mtDNA-STING介导的炎症信号传导来保护SALI。这些发现支持YHJF作为脓毒症相关肺损伤的潜在治疗策略。

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图文摘要

图1 YHJF对CLP诱导的脓毒症小鼠急性肺损伤的改善作用。A 实验时间线；B 肺组织HE染色及病理损伤评分；C 肺部Micro-CT成像；D 肺功能参数（呼吸频率、潮气量、肺顺应性）；E 肺湿/干重比；F 支气管肺泡灌洗液总蛋白含量；G 血清炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的mRNA表达水平。

图2 YHJF改善SALI小鼠的线粒体功能障碍。A火山图显示肺组织中的差异表达蛋白（DEPs），比较Sham组与CLP组、以及CLP组与YHJF组（n=6）；B 维恩图展示CLP与Sham组之间、以及YHJF与CLP组之间上调和下调DEPs的重叠情况；C GO富集分析，包含细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）；D Reactome通路富集分析；E 基于肺蛋白质组的免疫浸润分析。

图3 显示 YHJF 能够改善肺泡巨噬细胞的线粒体功能障碍。 其中，A–C 为在体实验：A 为肺组织 ROS 水平，B 为肺组织 ATP 水平，C 为肺组织 JC-1 检测（均 n=6），统计比较为与 CLP 组或 Sham 组比较；D–G 为体外 MH-S 细胞实验：D 为 ELISA 检测上清炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），E 为流式检测 ROS 荧光强度，F 为 ATP 水平，G 为 JC-1 染色观察线粒体膜电位（绿色单体/红色聚合物）

图4 GSEA分析（A）及热图（B）显示线粒体自噬通路激活；qRT‑PCR（C）和Western blot（D）分别检测MH‑S细胞中p62、LC3‑II、PINK1、Parkin的mRNA和蛋白水平；透射电镜（E）观察MH‑S细胞线粒体形态，免疫共定位（F）验证PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，TFAM/TOM20染色（G）检测线粒体DNA表达；此外，BALF来源细胞的电镜（H）和共定位（I）结果与MH‑S细胞一致。

图5 显示 YHJF 可抑制 LPS 刺激的 MH-S 巨噬细胞中 mtDNA–STING 炎症轴的激活。A 为蛋白质组 GSEA 分析（I 型干扰素信号通路）；B 为蛋白质组热图；C 为 qRT‑PCR 检测 TBK1、STING 和 IRF3 的 mRNA 水平；D 为 Western blot 检测 cGAS、p‑TBK1、p‑STING 和 p‑IRF3 的蛋白表达；E 为 p‑TBK1 与 p‑STING 的荧光共定位；F 为 qRT‑PCR 检测下游 IFN‑β、If44、Cxcl10 和 Isg15 的 mRNA 水平。

图6 通过药理学验证线粒体自噬参与 YHJF 介导的线粒体保护：
A、B 流式细胞术检测细胞内 ROS 水平及定量；C、D ATP 含量及定量；E、F JC‑1 单体比例评估线粒体膜电位；G、H qRT‑PCR 检测线粒体自噬相关 mRNA（PINK1、Parkin、LC3B、p62）并定量；I、J Western blot 检测相关蛋白（PINK1、Parkin、LC3‑II、p62）并定量；K 免疫荧光显示 PINK1 与 Parkin 共定位。

图7 YHJF 通过线粒体自噬途径抑制 LPS 刺激的 MH-S 细胞中 mtDNA-STING 通路的激活。A：TFAM 与 TOM20 免疫荧光共定位（n=3）；B、C：qRT-PCR 检测 TBK1、STING、IRF3 的 mRNA 表达（n=3）；D、E：Western blot 及定量检测总蛋白及磷酸化 TBK1、STING、IRF3（n=3）；F：p-TBK1 与 p-STING 免疫荧光共定位（n=3）。

图8 YHJF在共培养系统中通过调节巨噬细胞驱动的炎症减轻肺泡上皮细胞损伤。A、B：qRT-PCR检测MH-S细胞中炎症因子mRNA（A含IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β；B含IL-1β、IL-6、TNF-α，n=6）；C：共培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平（n=6）；D：流式细胞术检测与MH-S共培养后MLE-12细胞凋亡及定量（n=6）。

图9 分子对接验证 YHJF 缓解脓毒症急性肺损伤的核心机制：A 为 YHJF 主要活性成分与线粒体自噬靶点（PINK1、Parkin、LC3、p62）的结合评分热图；B 为各关键靶点中评分最优的配体‑靶点结合模式的代表性对接结果。

总结

该研究明确了益气活血解毒方缓解脓毒症肺损伤的核心免疫机制，弥补了SALI靶向治疗的机制研究空白。研究不仅从中医理论（正气亏虚、瘀毒互结）出发，更深入到现代分子免疫学层面（线粒体自噬、mtDNA-STING通路），体现了中西医结合研究的深度与创新性。

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