Science丨自我剪裁：Dystroglycan借磷酸酶之手雕琢糖链——为解析蛋白聚糖病的发病机制提供新视角

撰文|易

Dystroglycan （DG）是一种在多种多细胞生物中广泛表达的跨膜受体，在脑、肌肉和心脏的发育过程中发挥关键作用，同时也是旧世界沙粒病毒（如拉沙热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒）和致病菌（如麻风分枝杆菌）入侵宿主细胞的重要门户。 DG 的胞外区 α-DG 在其 黏 蛋白样结构域上携带一类高度复杂 的糖链修饰 ——matriglycan，该结构以磷酸化 O- 甘露糖三糖为核心，经 LARGE1 酶催化延伸形成由木糖（ Xyl ）与葡萄糖醛酸（ GlcA ）交替连接而成的线性重复序列。 Matriglycan 不仅是 DG 结合细胞外基质蛋白层粘连蛋白 球状 结构域的结构基础，也是病原体识别 DG 的关键位点。 matriglycan 合成通路中任 一 基因的突变都会导致 matriglycan 缺失或长度异常，引发以肌肉营养不良、脑发育异常和心肌病为特征的蛋白聚糖病 （ dystroglycanopathies ） ，且疾病严重程度与 matriglycan 链长密切相关。尽管已知 matriglycan 长度具有发育阶段与细胞类型特异性，但其精确调控机制长期未被阐明。已有临床证据表明， α-DG N 端结构域 （ α-DGN ）的 T192M 突变及该结构域的 缺失均 会导致 matriglycan 缩短并引发疾病，但 α-DGN 调控 matriglycan 延伸的具体分子机制仍不清楚，这为理解 DG 功能调控及相关疾病发病机理留下了关键空白。

近日，美国爱荷华大学Kevin P. Campbell在 Science 期刊上发表题为 Xylose phosphatase activity of dystroglycan self-regulates its receptor function 的研究论文，揭示经典细胞外基质受体Dystroglycan（DG）兼具木糖磷酸酶活性，通过“FAM20B磷酸化启动matriglycan合成—DG自身N端去磷酸化促进糖链延伸”的自我调控环路，精确控制其糖链受体功能，为解析蛋白聚糖病的发病机制提供了全新视角。

首先，作者通过有机化学合成手段构建了 LARGE1 酶识别的特异性底物 —— 连接甲基伞形酮的引物二糖 G4X-MU ，并以此为核心建立了体外酶活检测体系，结合高效液相色谱分离技术，系统筛选了高尔基体相关激酶家族成员，最终证实 FAM20B 能够以 ATP 依赖的方式高效催化该引物末端木糖残基的磷酸化修饰；为了排除其他激酶的交叉干扰并验证 内源性酶的 生理相关性，进一步构建了 FAM20B 敲除细胞系，通过对比野生型与敲除细胞裂解液 的酶活差异 ，确证了 FAM20B 是 介导该 反应的唯一关键激酶，随后精确锁定了磷酸化修饰位点位于木糖的 C2 位羟基，从化学结构层面完成了对FAM20B作为matriglycan引物木糖激酶的身份鉴定。

随后，作者利用该磷酸化产物 G4Xp-MU 作为底物，建立了体外 matriglycan 延伸反应体系，通过动力学参数测定与结合亲和力分析，发现 LARGE1 对磷酸化引物的催化效率与结合能力均显著优于非磷酸化引物，且能够合成出长度均一、结构规整的 matriglycan 聚合物，揭示了磷酸化修饰在 matriglycan 链起始合成中的分子开关作用；为了将这一体外发现转化为生理证据，作者构建了 FAM20B 全身敲减小鼠模型（因纯合敲除致死，采用出生后腺病毒 介 导的 shRNA 敲低策略 ），发现心脏组织中 FAM20B 的缺失直接导致 matriglycan 及 DG 受体自身的糖基化修饰程度显著降低，小鼠表现出发育迟缓、后肢挛缩及围产期死亡等严重表型，从而在整体动物水平验证了FAM20B介导的磷酸化是matriglycan正常起始合成及DG功能维持的必需环节。

在此基础上，基于生物信息学分析，发现 α-DG 的 N 端结构域 （ α-DGN ）含有一个高度保守的 DXDXT/V 基序，该基序与 卤代酸脱卤 酶（ HAD ）超家族磷酸水解酶的活性中心特征完全吻合，由此提出了 “ α-DGN 可能通过去磷酸化作用解除引物封锁，从而调控 matriglycan 延伸 ” 的假说；为了验证这一假说，作者从哺乳动物细胞中重组表达并纯化了高纯度的 α-DGN 蛋白，通过体外酶促反应与薄层色谱分析，证实 α-DGN 能够以金属离子依赖的方式特异性水解 G4Xp-MU 上的木糖磷酸基团，且该活性表现出显著的 pH 依赖性，随后通过构建定点突变体（将 DXD 基序中的天冬氨酸突变为天冬酰胺）并进行全长 DG 蛋白的功能回补实验，发现突变体完全丧失了水解磷酸根的能力，确证了 DXD 基序是 α-DGN 磷酸酶活性的催化核心，并通过合成结构中的甘露糖磷酸化底物进行交叉反应实验，排除了 α-DGN 对甘露糖磷酸的水解活性，明确了其底物特异性严格局限于 matriglycan 引物的木糖磷酸。

最后，为了将分子水平的 酶活发现 与复杂的生理表型直接关联，作者构建了分别靶向 α-DGN 两个 DXD 基序的小鼠模型，发现位于 S6 结构域的 D194N;D196N 突变（对应人源 D196N;D198N ）导致小鼠胚胎致死，而通过 Cre- loxP 系统构建的肌肉特异性突变小鼠则表现出严重的肌营养不良症状：免疫荧光与免疫印迹结果显示 matriglycan 链长显著缩短且层粘连蛋白结合能力丧失，组织病理学分析观察到肌纤维中心核化与纤维化，功能学检测进一步证实突变小鼠 存在抓 力下降、肌肉绝对收缩力与比张力减弱以及损伤后恢复能力受损等功能障碍，相比之下，位于免疫球蛋白结构域的 DXD 突变则未引起任何生化或表型异常，这一遗传学证据强有力地证明了 α-DGN 的木糖磷酸酶活性是 matriglycan 在体内正常延伸及肌肉生理功能维持的决定性因素。

综上所述 ，本研究提出DG通过“FAM20B磷酸化启动合成—α-DGN去磷酸化促进延伸”这一自我调控环路，实现了对其自身受体糖链长度与功能的精确控制，打破了以往认为DG仅为基质受体的传统认知，为其作为酶分子的双重身份提供了直接证据，也为理解蛋白聚糖病（ dystroglycanopathies ）的发病机制及开发相关干预策略提供了全新的分子视角。

https://doi.org/10.1126/science.adz7427

制版人： 十一

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