40 kDa 的蛋白跑成了 48 kDa？这 4 种 WB 异常，教你一次排查（含免费试用）

先看一个实验室常见的场景

跑胶、转膜、孵抗体——WB 是多数实验室每周都在做的常规操作，而 Marker 是整条流程里的标尺：泳道该切哪里、条带是不是目的蛋白、转膜有没有转过头，都靠它对位置。

标尺一歪，后面全乱。

但这些情况，你可能也遇到过

说明书标着 40 kDa 的蛋白，条带却稳稳停在 48 kDa 的位置；

同一支 Marker，换了块预制胶，整排条带集体「漂移」，高低调换了位置；

胶上跑得清清楚楚，WB 显影后 Marker 泳道却多出几条说不清的「幽灵带」；

组会汇报，被一句「你这个蛋白到底多大」问得没底。

多数人的第一反应是：这支 Marker 是不是坏了？

Marker 真的不准吗？

事实上：绝大多数「跑不准」，不是产品坏了，而是两件事没想明白——SDS-PAGE 这套方法本身的特性，和几个没控住的细节。

先说原理，再说怎么排查。

SDS-PAGE 测的从来不是「理论分子量」

SDS 之所以能让蛋白按大小分开，靠的是「饱和结合」：把蛋白拆成线性长链，按约 1:1.4（w/w）的比例、平均每 1.87 个氨基酸挂 1 个 SDS 分子，让每条肽链带上密度一致的负电荷——跑得快慢，就基本只取决于分子量。

但饱和结合有三个前提：游离 SDS 单体浓度够高、蛋白自身电荷能被完全屏蔽、蛋白不带影响迁移的修饰。任何一条不满足，迁移就会偏。

所以 SDS-PAGE 给出的是「表观分子量」—— 一个以标准品为参照的相对值。它和氨基酸序列算出来的理论值之间，本来就不承诺逐一对齐。理解了这一点，下面四类现象就都好解释了。

四类「跑不准」，逐个拆解

1

换了缓冲体系，条带整体漂移。

体系 pH 直接改变 SDS 与蛋白的结合效率：经典 Tris-Glycine 分离胶 pH 8.8，Bis-Tris 体系则是中性 pH（6.4～7.2）。典型如 6×His 标签蛋白——碱性条件下 His 咪唑基带正电，SDS 结合量下降，表观分子量偏大约 1 kDa；换到中性体系基本回归理论值。预染 Marker 的染料偶联会进一步放大这种体系依赖性，这是预染标准品的行业共性，不是某一家产品的缺陷。

对策：判读时对照说明书提供的对应体系校准图谱，不做跨体系直接比较；需要精确分子量时，用非预染 Marker 同胶标定。

同一蛋白（或同一支 Marker）在不同缓冲体系位置对比，直观呈现「为什么会不一样」

2

条带位置和理论值对不上。

方向不一、幅度不定？这多数不是「跑错了」，而是五类影响因素在起作用：氨基酸组成（疏水残基多则偏小）、缓冲体系 pH、天然电荷屏蔽不完全（强碱性蛋白如溶菌酶，净负电荷少约 12%，迁移慢、表观偏大）、游离 SDS 单体不足、以及糖基化等翻译后修饰（偏大数 kDa 到数十 kDa 都有可能）。

对策：别拿理论值目测对比。用相对迁移率 Rf（条带迁移距离 ÷ 染料前沿距离）对 Marker 分子量作标准曲线回归，R² ≥ 0.99 不难达到；大、中、小分子量区段函数形式不同，分段拟合更准。糖基化蛋白可结合去修饰酶处理或同体系文献值综合判断。

3

条带模糊、弥散、拖尾。

最常见的元凶是游离 SDS 单体浓度不够：高于 1 mM 时蛋白-SDS 达到饱和结合，迁移率线性最好；降到 0.5 mM 时结合比只剩 1:0.4，条带严重弥散。电泳缓冲液反复使用、样品含高盐，都会拉低有效单体浓度。此外，变性不充分（还原剂失效会形成二聚体「假条带」）、Marker 反复冻融、电压过高产热，也都会让条带变丑。

对策：电泳缓冲液新鲜配制，重复使用不超过 2～3 次；高盐样品先脱盐；上样缓冲液保证足量 SDS 和新鲜还原剂，70～90 ℃ 加热 5～10 min（Tris-Tricine / Bis-Tris 体系建议 70 ℃、10 min 温和变性）；Marker 分装冻存、避免反复冻融，上样前解冻混匀；经典电泳参数浓缩胶 80 V、分离胶 120 V 恒压，注意散热。

4

WB 显影后 Marker 区域出现杂带。

这是抗体与 Marker 重组蛋白组分的免疫交叉反应，不是 Marker「跑歪」。二抗非特异识别最常见；Marker 组分纯度不足时会进一步放大。

对策：最简单有效的一招——孵抗体前把 Marker 所在膜条剪开单独处理；再配合更换经交叉吸附处理的二抗、优化封闭与洗涤即可。

划重点：预染 Marker 准不准，别用「比位置」来判断

判断一支预染 Marker 准不准，很多同学习惯的做法是：把两个品牌的预染 Marker 上到同一块胶上，看条带对不对得齐——对不齐就断定「某支不准」。

这个思路本身就有问题：预染 Marker 的染料偶联都会带来体系依赖的表观偏差，两支都「偏」的产物互相比位置，谁也没资格当裁判。位置对不上，只能说明两者的染料修饰不同，不能说明谁不准。

正确的方法只有一个：用非预染 Marker 在同一块胶上校准预染 Marker。

非预染 Marker 不带染料修饰，分子量标定是行业金标准。以它制作标准曲线，再看预染 Marker 各条带的实际落点与标示值的吻合程度——这才是客观、可重复的判断依据。同一块胶、同一体系、同一批条件，变量全部拉平，结论才立得住。

这也是评价任何一支预染 Marker（包括各家进口品牌）的通行做法。

一页速查：体系与胶浓度怎么选

相当一部分「跑不准」，其实是体系选错了。常规参考：

分离胶浓度（以 Tris-Glycine 为例）：6% 对应 30～300 kDa，10% 对应 15～100 kDa，15% 对应 5～50 kDa，按目标蛋白落区间选。

最后，说说选 Marker 这件事

原理理顺、变量控住之后，如果一支 Marker 仍然跨体系漂移大、批次间不稳定、背景不干净——那才是产品本身的问题，值得换。

选型时认准两点：一看是否经过 Tris-Glycine、Bis-Tris 等多种主流体系的严格校准（表观分子量以非预染标准品为参照、在既定电泳条件下标定，即第六节的方法）；二看条带覆盖区间是否匹配自己的目标蛋白。

更稳妥的做法是「双 Marker 策略」：预染 Marker 盯电泳和转膜进程，非预染 Marker 做标准曲线定分子量——各司其职，互不将就。

最后一个小知识点，蛋白条带并不是越粗越好噢。随着蛋白质条带上样量不同，其上沿位置不变，下沿和中线位置随蛋白质量的增加而下移（冲），如下图，所以判断蛋白条带在哪个位置要记得看条带的上沿。

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8～180 kDa、10 条带，覆盖常规蛋白区间，即用型直接上样；

70 kDa（橙红）+ 8 kDa（绿色）双参照带，泳道上眼一扫就锁定位置；

表观分子量以市售非预染标准品为参照、同胶校准标定。

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结语

标尺稳了，数据才立得住。下次 Marker 再「跑歪」，先按这四类现象对号入座；要判断一支预染 Marker 到底准不准，记住——别比位置，用非预染校准。

内容策划：沈佳钰

内容审核：朱卿

题图来源：图虫创意