Acta Pharmacol Sin I 天然异黄酮射干素靶向EGFR-EGR2-Acot1轴改善HFpEF心肌脂质代谢异常！

2026年9月18日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院、浙江省心血管介入与精准医学重点实验室等单位研究团队在Acta Pharmacologica Sinica（中科院2区，IF=10.4）发表题为 “Tectorigenin alleviates HFpEF by targeting the EGFR-EGR2-Acot1 axis to improve myocardial lipid metabolism” 的研究论文。该研究由 Li-guo Wang 和 Ke Lin 共同第一作者完成，Guo-sheng Fu 和 Ya-ting Xu 为通讯作者。

射干素（Tectorigenin, Tec）是一种来源于传统中药的异黄酮类活性成分，已有研究提示其具有抗炎、抗氧化及代谢调节等多种药理作用。然而，Tec是否能够改善射血分数保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction, HFpEF），以及其潜在分子机制仍未完全明确。该研究建立高脂饮食（high-fat diet, HFD）联合L-NAME诱导的HFpEF小鼠模型，并结合RNA测序、网络药理学、分子对接、表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）、pull-down实验、染色质免疫共沉淀（ChIP）以及基因干预等多种技术，系统解析Tec发挥心脏保护作用的分子基础。

研究发现，Tec能够改善HFpEF小鼠的心脏舒张功能、心肌重构以及运动耐力，并且在HFpEF建立后给予Tec仍具有治疗作用。在细胞水平，Tec可缓解棕榈酸（palmitic acid, PA）诱导的心肌细胞脂毒性。机制研究进一步发现，Tec能够直接结合表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR），抑制EGFR异常激活，并通过EGFR-EGR2轴上调酰基辅酶A硫酯酶1（Acyl-CoA thioesterase 1, Acot1），改善心肌脂质代谢稳态。

该研究揭示了“Tec–EGFR–EGR2–Acot1”调控轴在HFpEF中的作用，为靶向心肌脂质代谢异常改善HFpEF提供了新的潜在干预策略。

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【摘 要】

背景：

射血分数保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction, HFpEF）约占全球心力衰竭病例的50%，但目前针对该疾病的有效靶向治疗仍然有限。射干素（Tectorigenin, Tec）是一种来源于传统中药的活性异黄酮类化合物，具有多种心血管保护作用，但其在HFpEF中的治疗潜力及作用机制尚不明确。

目的：

本研究旨在评价Tec对HFpEF的治疗作用，并解析其潜在分子机制。

方法：

研究采用高脂饮食（HFD）联合L-NAME建立HFpEF小鼠模型。在体内实验中，通过超声心动图、组织学染色、运动耐力测试、代谢检测以及分子生物学分析评价Tec作用。在体外实验中，利用棕榈酸（PA）刺激的新生大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs）模拟心肌细胞脂毒性。此外，研究结合RNA测序、网络药理学、分子对接、表面等离子共振（SPR）、pull-down实验、染色质免疫共沉淀（ChIP）以及基因沉默技术探索作用机制。

结果：

Tec能够减缓HFpEF进展，并且在HFpEF模型建立后给予Tec仍保持治疗效果。在体外，Tec能够减轻PA诱导的心肌细胞脂毒性。

机制研究发现，Tec可直接结合EGFR蛋白的E762/M793位点，并抑制EGFR异常激活。EGFR信号受到抑制后，下游EGFR-EGR2轴受到调控，进一步促进Acot1表达，从而改善心肌脂质代谢稳态。

心脏特异性Acot1敲低或药理学激活EGFR均可明显削弱Tec对心脏功能、心肌重构以及脂质代谢改善的作用。

结论：

Tec通过调控EGFR-EGR2-Acot1信号轴改善HFpEF，其作用机制与恢复心肌脂质代谢稳态密切相关，提示EGFR-EGR2-Acot1轴可能成为HFpEF治疗中的潜在干预方向。

01

研究背景及科学问题

心力衰竭（heart failure, HF）是一种由多种结构或功能异常导致的复杂临床综合征，可引起心室收缩和（或）舒张功能障碍，进一步导致心输出量下降、外周组织灌注不足以及肺循环和全身循环淤血。射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）是心力衰竭的重要亚型，约占全球心衰病例的50%。然而，与射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）相比，HFpEF目前仍缺乏明确有效的靶向治疗策略。现有用于HFrEF治疗的多种药物在HFpEF患者中的获益有限，目前钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2 inhibitors, SGLT2i）是少数被证实能够改善HFpEF预后的药物类别之一，但其具体作用机制仍未完全明确。因此，寻找新的HFpEF治疗靶点具有重要意义。

近年来，来源于传统中药的天然活性单体因具有多靶点调控、低毒性以及丰富药理活性的特点，逐渐成为心血管疾病干预研究的重要方向。射干素（Tec）是一种异黄酮类化合物，主要存在于射干（Iris tectorum）根部以及葛花（Pueraria lobata）中。已有研究发现，Tec具有抗癌、降糖、肝保护、抗炎、抗氧化以及神经保护等多种药理活性。

在心血管疾病研究中，Tec已被报道能够减轻压力负荷诱导的心肌肥厚，并改善糖尿病相关心肌纤维化，同时可通过抑制铁死亡减轻脓毒症相关心肌损伤。这些研究提示Tec具有潜在心脏保护作用。然而，目前尚无系统研究明确Tec是否能够直接改善HFpEF，以及其发挥心肌保护作用的具体分子机制。

表皮生长因子受体（EGFR）是一种重要的跨膜信号分子，在组织发育及疾病过程中发挥关键作用。已有研究发现，异常激活EGFR参与病理性心脏重构和心肌纤维化过程，而抑制EGFR信号能够改善部分心脏疾病模型中的舒张功能障碍。然而，Tec是否能够通过调节EGFR相关通路改善HFpEF仍有待研究。

此外，Acot1作为酰基辅酶A硫酯酶家族成员，在脂质代谢稳态调控中发挥重要作用。Acot1能够调节脂肪酸代谢，并在多种心肌损伤模型中发挥保护作用。由于脂质代谢紊乱和PPAR-α通路异常是HFpEF的重要病理特征，因此研究Tec与Acot1是否参与调控心肌脂质代谢，对于揭示HFpEF新的治疗机制具有重要意义。

02

重要发现及亮点

射干素可改善HFpEF小鼠心脏舒张功能并减轻心肌重构

为了明确射干素（Tectorigenin, Tec）是否能够改善射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的疾病表型，研究人员首先采用高脂饮食（high-fat diet, HFD）联合L-NAME的“两击（two-hit）”策略建立HFpEF小鼠模型。

研究人员使用8周龄雄性C57BL/6小鼠，通过HFD（60%热量来源于猪油）联合L-NAME饮水刺激诱导HFpEF模型。经过8周“两击”处理后，小鼠表现出明显的心脏舒张功能障碍，而收缩功能未发生明显改变。超声心动图检测显示，模型小鼠E/A和E/e′比值升高，提示左心室充盈压力增加；斑点追踪超声分析显示心肌整体纵向应变（global longitudinal strain, GLS）下降；冠状动脉血流储备（coronary flow reserve, CFR）亦受到损害。

在确认模型建立后，研究人员进一步评价Tec对HFpEF发生发展的影响。实验设置正常饮食对照组、HFpEF模型组以及低、高剂量Tec干预组，其中Tec剂量分别为25 mg/kg/d和75 mg/kg/d，经口灌胃给予。结果显示，Tec能够显著减轻HFpEF小鼠心脏舒张功能障碍，同时不影响射血分数（ejection fraction, EF），提示Tec主要改善心脏舒张功能，而非增强收缩功能。

进一步组织学分析显示，Tec能够改善HFpEF小鼠心脏扩大及心肌纤维排列紊乱。H&E染色显示Tec减轻了心脏结构异常；Masson三色染色和Sirius Red染色证实Tec减少了心肌纤维化，其中高剂量Tec作用更加明显。此外，Tec降低了肺重量/胫骨长度（LW/TL）比值，提示其能够缓解HFpEF相关肺淤血。

在功能评价方面，跑台运动实验显示Tec提高了HFpEF小鼠运动耐力，高剂量处理组改善更加明显。Western blot检测进一步发现，Tec呈剂量依赖性降低心肌纤维化相关蛋白Periostin（Postn）、α-SMA、CTGF以及心衰标志物ANP的表达。

此外，研究人员进一步观察Tec对HFpEF相关病理过程的影响。WGA染色和HW/TL比值分析显示，Tec能够减轻心肌细胞肥大；HFpEF模型中升高的MYH7以及炎症相关因子TNF-α、MCP-1表达均可被Tec剂量依赖性抑制。同时，Tec能够减少HFpEF心肌细胞凋亡水平，降低cleaved-caspase3表达异常变化。

除心脏表型外，Tec还改善了HFpEF相关代谢异常。Tec处理后，小鼠体重下降，葡萄糖耐量改善，血液胆固醇水平降低，同时收缩压和舒张压均下降。

综上，Tec能够有效抑制HFpEF模型中的心脏舒张功能障碍、心肌纤维化、心肌肥厚、炎症反应以及代谢异常，提示Tec具有改善HFpEF疾病进程的潜在作用。

图1：Tec prevents the progression of HFpEF in mice.

图1 射干素（Tec）可阻止HFpEF小鼠疾病进展。

a，动物实验处理时间流程图。

b，代表性M型超声心动图图像。右侧显示小鼠射血分数（EF）。

c，代表性二尖瓣血流速度图（上图）和二尖瓣环组织多普勒成像（TDI）图（下图）。右侧显示小鼠E/A和E/e′比值。

d，代表性心肌纵向应变图像。右侧显示小鼠整体纵向应变（GLS）。

e，代表性小鼠完整心脏H&E染色图像。

f，代表性Masson三色染色和Sirius Red染色心肌纤维化区域图像。右侧显示纤维化区域比例。

g，肺重量/胫骨长度（LW/TL）比值。

h，跑台耐力实验中的运动距离。

i，心脏组织中Postn、α-SMA、CTGF和ANP蛋白表达的代表性Western blot图像，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。

a–i，每组n=7。

****P < 0.0001，与Chow组相比；

< 0.05，# < 0.01，## < 0.001，### < 0.0001，与HFpEF组相比；

&P < 0.05，&&P < 0.01，与HFpEF+TEC25组相比。

EF，射血分数（ejection fraction）；E/A，舒张早期二尖瓣血流速度/舒张晚期二尖瓣血流速度；E/e′，舒张早期二尖瓣血流速度/二尖瓣环舒张早期速度；GLS，整体纵向应变（global longitudinal strain）；LW/TL，肺重量/胫骨长度。

射干素在HFpEF建立后仍具有治疗作用

在明确Tec能够预防HFpEF发生后，研究人员进一步探讨Tec对于已经形成的HFpEF是否仍具有治疗效果。

研究人员首先利用HFD联合L-NAME刺激小鼠8周建立HFpEF模型，随后继续给予Tec或vehicle处理4周，以模拟疾病形成后的干预模式。结果显示，与vehicle处理组相比，HFpEF建立后给予Tec并未改变射血分数（EF），但显著改善心脏舒张功能，表现为E/A和E/e′比值降低。

同时，Tec治疗改善了心肌功能指标，包括GLS升高、肺淤血减轻、运动耐力增加以及心脏肥厚减轻。进一步检测发现，Tec恢复了HFpEF小鼠心肌CPT1活性，并降低Postn、α-SMA、CTGF以及ANP等纤维化和心衰相关蛋白水平。组织学分析同样显示Tec减少了Masson染色和Sirius Red染色所反映的心肌纤维化。

这些结果表明，Tec不仅能够预防HFpEF相关病理改变，在HFpEF形成后仍具有一定治疗作用。

射干素缓解PA诱导的心肌细胞脂毒性

为了进一步探索Tec保护心肌的细胞基础，研究人员建立棕榈酸（palmitic acid, PA）诱导的新生大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs）脂毒性模型。

首先，通过CCK-8实验评价Tec的细胞毒性。结果显示，80 μM Tec处理导致明显细胞毒性并降低细胞活力。因此，后续实验选择20 μM和40 μM Tec作为干预浓度。

在PA刺激条件下，心肌细胞活力明显下降，而20 μM和40 μM Tec均能够发挥保护作用。进一步Western blot检测发现，PA诱导pro-caspase3降低、cleaved-caspase3升高，提示细胞凋亡增加；Tec处理能够逆转这些变化，减少PA诱导的心肌细胞凋亡。

流式细胞术Annexin V/PI双染结果进一步验证，PA显著增加心肌细胞凋亡比例，而Tec能够降低凋亡细胞比例。

此外，PA刺激导致心肌细胞脂滴大量积累。Oil Red O染色显示，Tec能够显著减少细胞内脂滴沉积，缓解脂质过载。同时，PA诱导的ROS过量产生也被Tec明显抑制，提示Tec能够减轻氧化应激损伤。

因此，体外实验表明，Tec能够通过抑制凋亡、脂质积累以及氧化应激，缓解PA诱导的心肌细胞脂毒性。

图2：Tec mitigates PA-mediated cardiomyocyte lipotoxicity.

图2 射干素（Tec）缓解PA介导的心肌细胞脂毒性。

a，CCK-8检测不同浓度Tec处理NRVMs后的细胞活力。n=3/组。****P < 0.0001，与0 μM Tec相比。

b，PA处理NRVMs后，不同浓度Tec干预的细胞活力检测。n=3/组。****P < 0.0001，与0 μM PA相比；## < 0.001，### < 0.0001，与400 μM PA相比。

c，NRVMs中pro-caspase3和cleaved-caspase3蛋白表达的代表性Western blot图像，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。

d，Annexin V/PI双染流式细胞术检测NRVMs凋亡的代表性结果。右侧显示凋亡率相对定量。

e，NRVMs脂滴积累的Oil Red O染色代表性图像。右侧显示细胞内脂滴沉积相对定量。

f，NRVMs中ROS水平荧光检测代表性图像。右侧显示ROS荧光强度相对定量。

c–f，每组n=5。

****P < 0.0001，与Vehicle组相比；

< 0.05，## < 0.001，### < 0.0001，与PA组相比；

&P < 0.05，与PA+TEC 20 μM组相比。

CCK-8，细胞计数试剂盒-8；ROS，活性氧。

射干素通过上调Acot1改善HFpEF心肌脂质代谢异常

为了进一步解析Tec改善HFpEF的分子机制，研究人员对正常对照组、HFpEF模型组以及Tec干预HFpEF组小鼠左心室组织进行了RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析。

首先，主成分分析（principal component analysis, PCA）结果显示，三组样本在转录表达谱上形成了明显不同的聚类，提示HFpEF模型建立以及Tec干预均导致了显著的基因表达变化。研究人员进一步筛选HFpEF组与HFpEF+Tec组之间的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），筛选标准为校正后P值（adjusted P value）<0.05以及绝对log2 fold change > log2 1.5。

KEGG通路富集分析显示，Tec干预后发生变化的差异基因主要富集于脂质代谢相关通路，而脂质代谢异常被认为是HFpEF发生发展的重要病理基础。进一步基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示，与HFpEF模型组相比，Tec处理组心肌组织脂肪酸降解能力明显增强，提示脂肪酸代谢恢复可能是Tec改善HFpEF的重要机制之一。

与转录组分析结果一致，Tec能够逆转HFpEF状态下脂肪酸代谢关键调控蛋白的异常变化，包括肉碱棕榈酰转移酶1B（carnitine palmitoyltransferase 1B, CPT1B）、羟酰辅酶A脱氢酶亚基（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional multienzyme complex subunit alpha, HADHA）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPAR-α）以及NADH脱氢酶铁硫蛋白8（NDUFS8）。同时，Tec恢复了心肌PGC-1α和CPT1A表达，提示其可能促进线粒体氧化代谢以及脂肪酸进入线粒体的过程。

进一步检测显示，Tec处理显著提高HFpEF小鼠心肌CPT1活性，而CPT1是介导肉碱依赖性脂质转运进入线粒体的重要酶。

随后，研究人员通过Venn分析进一步筛选Tec调控的关键候选基因。在Control与HFpEF比较中获得462个差异表达基因，在HFpEF与HFpEF+Tec比较中获得488个差异表达基因，两组交集获得99个共同基因。经过低表达基因过滤后，最终筛选得到13个候选基因。

在这些候选基因中，Acot1表现出最显著的Tec响应变化。Acot1编码酰基辅酶A硫酯酶1（Acyl-CoA thioesterase 1），是调控脂质代谢的重要蛋白。火山图分析显示，Tec处理后Acot1以及多个脂质代谢相关基因表达明显升高。进一步热图分析显示，Tec降低了损伤、心室重构以及脂质代谢异常相关基因表达，同时进一步提高Acot1水平。

RT-qPCR验证结果显示，在Tec诱导升高的多种脂质代谢相关基因中，Acot1表达升高最为显著；Western blot进一步证实，HFpEF小鼠心肌中Acot1蛋白水平升高，并且Tec处理后进一步增加。

这些结果提示，Acot1可能是Tec改善HFpEF过程中调控心肌脂质代谢的重要下游分子。

图3：Tec upregulates Acot1 and ameliorates lipid metabolism in HFpEF heart.

图3 射干素（Tec）上调Acot1并改善HFpEF心脏脂质代谢。

a，正常对照组、HFpEF组以及HFpEF+Tec组左心室组织RNA测序样本的主成分分析（PCA）。

b，HFpEF组与HFpEF+Tec组之间差异表达基因的KEGG通路富集分析。

c，HFpEF组与HFpEF+Tec组之间脂肪酸降解通路的基因集富集分析（GSEA）。

d，Western blot检测心肌组织中脂肪酸代谢相关蛋白CPT1B、HADHA、PPAR-α和NDUFS8表达水平。右侧显示灰度定量分析。

e，心肌CPT1活性检测。

f，Control与HFpEF组以及HFpEF与HFpEF+Tec组差异表达基因交集分析的Venn图。

g，差异表达基因火山图分析。

h，候选基因表达热图分析。

i，RT-qPCR检测心肌组织中候选脂质代谢相关基因表达。

j，Western blot检测心肌组织中Acot1蛋白表达水平，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。

a–j实验具体样本量及统计学信息见原文图注。

射干素通过Acot1介导改善HFpEF心脏功能及脂质代谢稳态

在发现Tec能够上调Acot1表达并改善HFpEF心肌脂质代谢后，研究人员进一步验证Acot1是否是Tec发挥心脏保护作用的关键介质。

研究人员利用AAV9-cTNTp-shAcot1病毒系统实现心脏特异性Acot1敲低，并评价Acot1缺失对Tec治疗效果的影响。AAV9-cTNTp-shAcot1经尾静脉注射后，可使心肌组织Acot1蛋白表达降低约60%，且这种敲低具有心脏组织特异性，在肝脏、肾脏、脑以及骨骼肌中未观察到明显Acot1表达变化。进一步分离心肌细胞（cardiomyocytes, CMs）、心脏成纤维细胞（fibroblasts, FBs）以及内皮细胞（endothelial cells, ECs）后发现，Acot1主要在心肌细胞中被有效敲低，而成纤维细胞和内皮细胞中的Acot1水平未明显改变。

随后，研究人员在HFpEF小鼠中评价Acot1敲低对于Tec保护作用的影响。结果显示，Acot1敲低并未明显影响Tec对于心肌收缩功能的改善，但显著削弱了Tec对舒张功能的保护作用。超声心动图分析显示，Acot1敲低后，左心室充盈压力指标E/A和E/e′比值升高，Tec改善心室顺应性的作用部分消失。

组织学检测进一步证实，Acot1缺失削弱了Tec改善心脏扩大和心肌纤维化的效果。Masson三色染色及Sirius Red染色显示，Acot1敲低后Tec减少纤维化面积的能力明显下降。同时，Tec改善肺淤血和运动耐力的作用也受到明显影响。

Western blot检测发现，Tec能够降低HFpEF小鼠心肌纤维化相关蛋白Postn、α-SMA、CTGF以及心衰标志物ANP表达，而Acot1敲低部分逆转了这些作用。此外，Acot1缺失还削弱了Tec对于心肌肥大、炎症反应、细胞凋亡以及脂肪酸氧化相关蛋白恢复的调节作用，并降低Tec恢复CPT1活性的能力。

值得注意的是，心肌特异性Acot1敲低并未影响Tec对于代谢综合征指标和循环血压的改善，提示Acot1主要介导Tec在心肌局部的保护作用，而不是其全身代谢调节效应。

进一步研究Acot1本身在HFpEF中的作用发现，在HFD+L-NAME诱导的HFpEF模型中，Acot1敲低本身即可进一步加重舒张功能障碍、降低心肌应变能力、增加肺淤血和心肌肥厚，并降低运动耐力。同时，Acot1缺失降低心肌CPT1活性，提高Postn、α-SMA、CTGF和ANP表达，并促进心肌纤维化。

这些结果说明，Acot1不仅是Tec发挥保护作用的重要下游分子，同时也是维持HFpEF心肌脂质代谢稳态和功能的重要保护性调控因子。

射干素通过Acot1缓解PA诱导的心肌细胞脂毒性

为了进一步明确Acot1在Tec改善心肌细胞脂毒性中的作用，研究人员在PA刺激的NRVM模型中进行了验证。

首先，研究人员检测PA和Tec处理后Acot1蛋白水平变化。结果显示，与动物实验结果一致，PA刺激能够提高Acot1蛋白表达，而Tec处理可进一步剂量依赖性增加Acot1水平。随后利用siRNA敲低Acot1表达，建立Acot1缺失细胞模型。

在PA刺激条件下，心肌细胞出现凋亡增加表现，包括pro-caspase3下降以及cleaved-caspase3升高。Tec能够逆转这些变化，但Acot1敲低后，Tec调节凋亡相关蛋白的作用明显减弱。流式细胞术进一步显示，Tec能够降低PA诱导的心肌细胞凋亡比例，而Acot1缺失削弱了这一抗凋亡作用，使细胞凋亡水平恢复至接近PA模型组。

在脂质代谢方面，Tec能够减少PA诱导的细胞内脂滴积累并缓解脂质过载，而Acot1敲低阻断了Tec清除脂滴的作用，使脂滴数量和面积明显增加。ROS检测进一步显示，Tec能够抑制PA诱导的ROS升高，但Acot1缺失可逆转这一抗氧化作用。

进一步的直接结合实验显示，Tec并不能直接结合Acot1。体外pull-down实验以及细胞热迁移实验（cellular thermal shift assay, CETSA）均未发现Tec与Acot1之间存在直接结合关系。

因此，Acot1虽然是Tec发挥保护作用的重要靶点，但Tec并非通过直接结合Acot1发挥作用，而是需要进一步寻找Tec调控Acot1表达的直接作用分子。

图4：Knockdown of Acot1 blocks the protective effects of Tec in HFpEF.

图4 Acot1敲低阻断射干素（Tec）对HFpEF的保护作用。

a，动物实验处理时间流程图。

b，代表性M型超声心动图图像。右侧显示小鼠EF。

c，代表性二尖瓣血流速度图（上图）及二尖瓣环TDI图（下图）。右侧显示E/A和E/e′比值。

d，代表性心肌纵向应变图像。右侧显示GLS。

e，代表性小鼠完整心脏H&E染色图像。

f，代表性Masson三色染色和Sirius Red染色心肌纤维化区域图像。右侧显示纤维化面积比例。

g，LW/TL比值。

h，跑台耐力实验运动距离。

i，心脏组织中Postn、α-SMA、CTGF和ANP蛋白表达的代表性Western blot图像，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。

a–i，每组n=7。

****P < 0.0001，与Chow组相比；

## < 0.001，### < 0.0001，与HFpEF组相比；

&P < 0.05，&&P < 0.01，&&&P < 0.001，&&&&P < 0.0001，与HFpEF+Tec75组相比。

EF，射血分数；E/A，舒张早期二尖瓣血流速度/舒张晚期二尖瓣血流速度；E/e′，舒张早期二尖瓣血流速度/二尖瓣环舒张早期速度；GLS，整体纵向应变；LW/TL，肺重量/胫骨长度。

图5：Acot1 knockdown impairs Tec’s protection against cardiomyocyte lipotoxicity.

图5 Acot1敲低削弱射干素对心肌细胞脂毒性的保护作用。

a，NRVMs中Acot1蛋白表达的代表性Western blot图像，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。n=5/组。

***P <0.001，****P <0.0001，与0 μM Tec相比。

b，NRVMs中Acot1 siRNA敲低效率检测的代表性Western blot图像，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。n=3/组。

***P <0.001，与NCsi相比。

c，NRVMs中pro-caspase3和cleaved-caspase3蛋白表达代表性Western blot图像，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。

d，Annexin V/PI双染流式细胞术检测NRVMs凋亡代表性结果。右侧显示凋亡率相对定量。

e，NRVMs脂滴积累Oil Red O染色代表性图像。右侧显示细胞内脂滴沉积定量。

f，NRVMs ROS水平荧光检测代表性图像。右侧显示ROS荧光强度定量。

c–f，每组n=5。

****P <0.0001，与Vehicle组相比；

## <0.001，### <0.0001，与PA组相比；

&P <0.05，&&P <0.01，与PA+Tec 40 μM组相比。

ROS，活性氧；siRNA，小干扰RNA。

射干素直接结合EGFR并作为EGFR抑制剂发挥作用

由于前期研究发现Acot1是Tec发挥心肌保护作用的重要下游分子，但Tec并不能直接结合Acot1，因此研究人员进一步寻找Tec调控Acot1表达的直接作用靶点。

研究人员首先利用网络药理学方法筛选Tec可能作用的关键靶点。结果显示，Tec预测靶点与HFpEF相关靶点存在42个共同交集。随后，通过蛋白互作网络（protein-protein interaction, PPI）分析发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）位于网络核心位置，提示EGFR可能是Tec发挥作用的重要靶点。

进一步检测HFpEF小鼠心脏组织发现，HFpEF状态下EGFR异常激活，而Tec处理能够明显降低EGFR磷酸化水平，提示Tec可能抑制HFpEF相关EGFR过度激活。

为了验证Tec与EGFR之间是否存在直接结合关系，研究人员首先利用表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）实验进行检测。结果显示，Tec能够直接与EGFR结合，其结合动力学分析显示两者之间存在微摩尔级亲和作用，解离常数（KD）为6.78×10⁻⁵ M。

随后，研究人员进一步采用体外pull-down实验验证Tec与EGFR的直接结合关系。实验中，将Tec偶联于CNBr活化Sepharose 4B磁珠，并使用经典EGFR抑制剂Erlotinib作为阳性对照。结果证实，Tec能够直接结合具有生物活性的重组EGFR蛋白。

为了进一步解析Tec与EGFR的结合模式，研究人员进行了分子对接模拟。结果预测EGFR蛋白中两个空间邻近的氨基酸残基——谷氨酸762位点（E762）和蛋氨酸793位点（M793）可能参与Tec结合。

随后，研究人员构建FLAG标记EGFR野生型（EGFR WT）质粒，并通过定点突变将E762和M793分别突变为丙氨酸，获得EGFR E762A/M793A双突变体（EGFR 2A）。在H9C2细胞中表达EGFR WT或EGFR 2A后，通过Tec偶联磁珠进行pull-down检测。结果显示，E762A和M793A双突变完全破坏了Tec与EGFR之间的结合。

进一步的CETSA实验显示，Tec能够剂量依赖性提高EGFR WT蛋白热稳定性，但无法稳定EGFR 2A突变蛋白，进一步证明E762和M793是Tec结合EGFR的重要位点。

综上，研究表明Tec能够直接结合EGFR，并通过E762和M793关键位点发挥EGFR抑制作用。

图6：Tec directly binds to EGFR at specific sites and acts as an EGFR inhibitor.

图6 射干素直接结合EGFR特定位点并发挥EGFR抑制作用。

a，Tec预测靶点与HFpEF相关靶点交集的Venn图。

b，42个共同靶点的蛋白互作网络（PPI）分析，EGFR作为核心节点。

c，Western blot检测HFpEF小鼠心脏组织中EGFR磷酸化水平变化。

d，SPR实验检测Tec与EGFR之间的直接结合关系，显示两者之间存在微摩尔级结合亲和力。

e，利用CNBr活化Sepharose 4B磁珠进行Tec-EGFR体外pull-down实验，Erlotinib作为阳性对照。

f，Tec与EGFR结合模式的分子对接分析，预测E762和M793为潜在结合位点。

g，EGFR WT和EGFR E762A/M793A双突变体（EGFR 2A）构建示意图。

h，Tec偶联磁珠pull-down检测Tec与EGFR WT或EGFR 2A结合能力。

i、j，CETSA检测Tec对EGFR WT和EGFR 2A热稳定性的影响。

EGFR激活削弱射干素对心肌脂毒性的保护作用，并通过EGR2-Acot1轴发挥调控作用

在确认Tec能够直接结合并抑制EGFR后，研究人员进一步探讨EGFR信号是否参与Tec改善心肌脂毒性的过程。

首先，研究人员利用EGFR激动剂NSC228155激活EGFR通路，并通过CCK-8实验确定适合的实验浓度。结果显示，NSC228155在10 μM及以下浓度不会明显影响基础细胞活力，而12.5 μM和15 μM会降低细胞活力，因此后续实验选择10 μM NSC228155。

在PA诱导的NRVM脂毒性模型中，Tec能够明显恢复细胞活力，而EGFR激活剂NSC228155处理后，Tec的保护作用显著减弱。

Western blot结果显示，NSC228155削弱了Tec提高pro-caspase3以及降低cleaved-caspase3的作用。流式细胞术进一步证实，Tec能够降低PA诱导的心肌细胞凋亡比例，而EGFR激活可抵消这一抗凋亡作用，使细胞凋亡水平恢复至PA模型组水平。

在脂质代谢方面，Tec能够减少PA诱导的细胞内脂滴积累，而NSC228155预处理阻断了Tec促进脂滴清除的作用，使脂滴数量和面积明显增加。ROS检测显示，Tec能够抑制PA诱导的氧化应激，而EGFR激活能够逆转这一抗氧化作用。

进一步机制研究发现，EGFR激活后，Acot1蛋白表达明显降低，提示EGFR信号可能通过抑制Acot1参与调节Tec保护作用。

研究人员进一步关注EGR2（early growth response 2）。EGR2是一种转录因子，同时也是EGFR信号下游调控分子，并参与Acot1表达调节。Western blot结果显示，Tec处理能够降低EGR2表达，而EGFR激活能够部分逆转Tec对EGR2的抑制作用。

为了验证EGR2功能，研究人员利用siRNA敲低EGR2。结果显示，EGR2沉默能够显著提高Acot1表达，其效果与Tec处理相似。同时，EGR2敲低能够模拟Tec作用，降低脂毒性诱导的心肌细胞凋亡。

进一步实验显示，在PA、Tec以及EGFR激动剂共同处理条件下，EGR2敲低能够阻断EGFR激活对Tec诱导Acot1上调作用的抑制。相反，EGR2过表达能够削弱Tec对于细胞凋亡、脂质积累以及氧化应激的保护作用。

这些结果表明，Tec通过抑制EGFR信号降低EGR2表达，从而解除EGR2对Acot1的调控限制，提高Acot1水平并保护心肌细胞免受脂毒性损伤。

图7：EGFR agonist impairs Tec’s protection against cardiomyocyte lipotoxicity via the EGR2-Acot1 axis.

图7 EGFR激活通过EGR2-Acot1轴削弱射干素对心肌细胞脂毒性的保护作用。

（注：Fig.7图注位于PDF后续页面，当前读取范围仅包含前半部分正文及Fig.7开始前内容，完整图注将在下一部分读取后继续补全，避免根据实验内容自行扩展。）

EGR2介导EGFR-Acot1调控轴并直接调节Acot1转录

在发现EGFR激活能够削弱Tec诱导的Acot1表达升高后，研究人员进一步探讨EGFR下游分子如何调控Acot1。

研究发现，EGR2（early growth response 2）是EGFR信号的重要下游调控因子，同时也是Acot1表达调节相关转录因子。Tec处理能够降低NRVMs中EGR2蛋白表达，而EGFR激活则能够部分逆转Tec对EGR2的抑制作用。

进一步利用EGR2特异性siRNA进行敲低实验发现，EGR2沉默能够显著提高Acot1表达水平，其作用效果与Tec处理相似。同时，在PA诱导的心肌细胞脂毒性模型中，EGR2敲低能够模拟Tec的保护作用，减少心肌细胞凋亡。

在PA、Tec以及EGFR激动剂共同处理条件下，研究人员进一步观察到，EGR2敲低能够阻断EGFR激活对于Tec诱导Acot1表达升高的抑制作用。相反，EGR2过表达（Ad-EGR2）能够明显削弱Tec对于心肌细胞凋亡、脂质积累以及氧化应激的保护作用。

为了进一步证明EGR2是否直接调控Acot1表达，研究人员首先利用JASPAR数据库预测Acot1启动子调控区域中的EGR2潜在结合位点。随后，染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）实验验证了EGR2能够结合Acot1启动子区域。ChIP-qPCR结果进一步证实，与IgG阴性对照相比，EGR2抗体能够显著富集预测结合区域，证明EGR2能够特异性结合Acot1调控区域。

这些结果表明，Tec通过抑制EGFR信号降低EGR2表达，从而解除EGR2对Acot1表达的调控作用，提高Acot1水平并保护心肌细胞免受脂毒性损伤。其中，EGR2是连接EGFR信号和Acot1表达的重要调控节点。

EGFR通路激活阻断射干素对HFpEF的治疗作用

为了进一步在动物水平验证EGFR信号在Tec改善HFpEF过程中的关键作用，研究人员在HFpEF小鼠模型中给予EGFR激动剂NSC228155，并观察其是否能够削弱Tec的治疗效果。

实验中，HFpEF小鼠接受Tec联合NSC228155处理。结果显示，NSC228155并未明显影响Tec对于心肌收缩功能的作用，但显著降低了Tec对于舒张功能障碍的改善效果。超声心动图检测发现，与单独Tec治疗组相比，联合NSC228155处理后，小鼠左心室充盈压力相关指标E/A和E/e′比值明显升高，提示Tec改善心室舒张功能和顺应性的作用受到抑制。

进一步组织学分析显示，EGFR激活明显削弱了Tec减轻心脏扩大和心肌纤维化的作用。Masson三色染色和Sirius Red染色结果表明，NSC228155处理后，Tec降低心肌纤维化程度的效果明显下降。同时，Tec改善HFpEF相关肺淤血以及运动耐力下降的作用也被显著削弱。

Western blot结果显示，Tec能够降低HFpEF心肌组织中纤维化相关蛋白及心衰标志物表达，而NSC228155能够部分逆转Tec产生的调节作用。进一步检测发现，EGFR激活削弱了Tec对于心肌肥大、HW/TL比值以及MYH7、TNF-α和MCP-1表达的改善作用，同时降低了Tec对于细胞凋亡和脂肪酸氧化相关蛋白恢复的影响。

此外，NSC228155处理后，心肌组织中EGR2表达升高，而Acot1表达降低，进一步支持EGFR-EGR2-Acot1信号轴参与Tec介导的心脏保护作用。值得注意的是，EGFR激活并未影响Tec对于代谢综合征指标和循环血压的改善作用，提示EGFR主要参与Tec在心肌组织中的保护效应。

综上，EGFR通路激活能够显著阻断Tec改善HFpEF的作用，进一步验证EGFR是Tec发挥心脏保护作用的重要功能靶点。

射干素在人源iPSC来源心肌细胞中验证EGFR-EGR2-ACOT1调控轴

为了进一步评价Tec作用机制的潜在转化价值，研究人员在人诱导多能干细胞来源心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, iPSC-CMs）中进行了验证。

研究人员首先利用已建立的小分子诱导分化方法获得iPSC-CMs。随后使用PA刺激模拟心肌细胞脂毒性损伤。结果显示，PA处理显著增加iPSC-CMs中cleaved-caspase 3表达，提示细胞凋亡增强；而Tec处理能够明显降低cleaved-caspase 3水平，减轻PA诱导的凋亡反应。

进一步机制检测显示，Tec能够抑制PA诱导的EGFR磷酸化，同时降低EGR2表达并提高ACOT1表达。在人源iPSC-CMs中，Tec同样能够重现啮齿类心肌细胞中观察到的EGFR-EGR2-ACOT1调控关系。

这些结果进一步支持Tec通过调控EGFR-EGR2-Acot1轴发挥心肌保护作用，并为该机制向人源细胞模型中的延伸提供实验依据。

图8：Activation of the EGFR pathway blocks the therapeutic effects of Tec in HFpEF.

图8 EGFR通路激活阻断射干素对HFpEF的治疗作用。

a，动物实验处理时间流程图。

b，代表性M型超声心动图图像。右侧显示小鼠EF。

c，代表性二尖瓣血流速度图（上图）和二尖瓣环TDI图（下图）。右侧显示小鼠E/A和E/e′比值。

d，代表性心肌纵向应变图像。右侧显示GLS。

e，代表性小鼠完整心脏H&E染色图像。

f，代表性Masson三色染色和Sirius Red染色心肌纤维化区域图像。右侧显示纤维化面积比例。

g，LW/TL比值。

h，跑台耐力实验运动距离。

i，心脏组织中Postn、α-SMA、CTGF和ANP蛋白表达的代表性Western blot图像，GAPDH作为内参。右侧显示灰度定量分析。

a–i，每组n=7。

****P <0.0001，与Chow组相比；

## <0.001，### <0.0001，与HFpEF组相比；

&&P <0.01，&&&P <0.001，&&&&P <0.0001，与HFpEF+Tec75组相比。

EF，射血分数（ejection fraction）；E/A，舒张早期二尖瓣血流速度/舒张晚期二尖瓣血流速度；E/e′，舒张早期二尖瓣血流速度/二尖瓣环舒张早期速度；GLS，整体纵向应变（global longitudinal strain）；LW/TL，肺重量/胫骨长度。

【贡献】★★★★★

本研究发现，天然异黄酮类化合物射干素（Tectorigenin, Tec）能够改善射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的心脏功能障碍及病理重构。

研究人员利用HFD联合L-NAME建立HFpEF小鼠模型，发现Tec不仅能够预防HFpEF相关病理改变，在疾病形成后给予治疗同样能够改善心脏舒张功能、心肌纤维化、运动耐力下降以及心肌代谢异常。

机制研究显示，Tec并非直接结合Acot1，而是通过直接结合表皮生长因子受体（EGFR），抑制EGFR异常激活。随后，EGFR下游转录因子EGR2受到调控，导致Acot1表达升高，从而促进心肌脂质代谢恢复并缓解脂毒性损伤。

进一步实验表明，心肌特异性Acot1敲低或EGFR药理学激活均能够削弱Tec对于HFpEF的保护作用，证明EGFR-EGR2-Acot1轴是Tec发挥心肌保护作用的重要调控通路。

此外，在人源iPSC来源心肌细胞中，Tec同样能够调节EGFR-EGR2-ACOT1轴并减轻PA诱导的细胞凋亡，进一步支持该机制的转化潜力。

总体而言，本研究揭示了Tec通过靶向EGFR-EGR2-Acot1轴改善心肌脂质代谢稳态，从而缓解HFpEF的新机制，为天然产物调控心肌代谢重塑提供了新的研究方向。

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