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人CXC趋化因子受体3(CXCR3)ELISA Kit
作者:深圳市恒昊生物科技有限公司
CXCR3 ELISA Kit检测原理
商业化CXCR3 ELISA Kit以双抗体夹心法为核心检测原理，适用于血清、血浆、细胞培养上清、组织匀浆等多种样本的可溶性CXCR3定量检测，具体机制如下：
- 固相包被：试剂盒预先将高特异性的抗人CXCR3单克隆抗体包被在96孔微孔板的固相载体表面，通过疏水作用力稳定结合，洗涤去除未吸附的游离抗体后，微孔板表面仅保留可特异性捕获CXCR3的包被抗体。
- 抗原捕获：向微孔中加入梯度稀释的标准品或预处理后的待测样本，在适宜温度下孵育，样本中的可溶性CXCR3会与固相表面的捕获抗体发生特异性结合，固定在微孔中；后续洗涤步骤可去除未结合的杂蛋白、细胞碎片等杂质。
- 夹心复合物形成：加入生物素标记的抗人CXCR3多克隆检测抗体，该抗体可识别CXCR3上不同于捕获抗体的另一抗原表位，与已结合在固相上的CXCR3特异性结合，形成「包被抗体-CXCR3-生物素化检测抗体」的双抗夹心结构。
- 酶标记物结合：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，利用生物素与链霉亲和素的高亲和力特性，使HRP与夹心复合物稳定结合，洗涤去除未结合的游离酶标记物。
- 显色反应与定量：加入HRP的特异性底物TMB（四甲基联苯胺），结合在复合物上的HRP可催化无色的TMB氧化为蓝色产物；加入酸性终止液后反应终止，蓝色产物转变为黄色。在一定浓度范围内，反应体系的颜色深浅与样本中CXCR3的浓度呈正相关。
检测操作注意事项
（一）样本采集与保存
- 样本类型适配：不同来源样本需按规范处理：
- 血清样本：使用无热原、无内毒素的采血管采集，室温静置30分钟待血液凝固后，3000g离心15分钟取上清，避免溶血（溶血会导致红细胞内蛋白释放，引发非特异性结合）。
- 血浆样本：推荐使用EDTA或肝素抗凝管，避免使用枸橼酸钠抗凝（枸橼酸盐会影响HRP酶活性），采集后30分钟内3000g离心15分钟取上清。
- 细胞培养上清：收集上清后4℃下1000g离心10分钟去除细胞沉淀，取上清检测；若为贴壁细胞，避免刮取细胞时混入细胞碎片。
- 组织匀浆样本：取新鲜组织用预冷的PBS漂洗去除血液，剪碎后加入蛋白酶抑制剂匀浆，4℃下12000g离心10分钟取上清，避免反复冻融导致蛋白降解。
保存规范：样本采集后2小时内未检测的，需分装后置于-20℃短期保存（1个月内），长期保存需置于-80℃，严禁反复冻融（反复冻融会导致CXCR3蛋白构象破坏，检测结果偏低30%以上）。
（二）试剂准备
- 试剂盒平衡：实验前需将所有试剂盒组分从2-8℃储存环境中取出，室温（20-25℃）平衡30-60分钟，避免因温度不均导致的孔间反应差异，影响标准曲线线性度。
- 试剂配制要求
- 标准品需现用现配，按照说明书要求用配套稀释液进行梯度稀释，稀释过程中需充分吹打混匀，避免浓度梯度偏差；若检测样本基质特殊（如脑脊液、关节腔积液），推荐使用与样本基质一致的液体稀释标准品，降低基质效应干扰。
- 浓缩洗涤液若在低温下出现结晶，需置于37℃水浴中完全溶解后再配制使用，结晶残留会导致洗涤不充分，造成背景值偏高。
- TMB底物液需避光保存，使用前观察是否变色，若未加样即呈现蓝色，说明底物已被氧化，需更换试剂。
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