ADC内吞检测的「假阳性」是怎么来的？（内吞新品体验计划）

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对于依赖内吞机制的ADC，内吞效率是评估药物递送能力和作用机制的重要指标。随着抗体形式和ADC结构设计不断丰富，研究人员对内吞检测的灵活性和适用范围也提出了更高要求。

内吞检测（internalization assay）看着简单——把抗体标上荧光、跟细胞孵一会儿、上机读信号。可真正做过的人都知道，"膜表面结合"和"被吞进胞内酸性区室"这两件事，在传统方案里往往长得一模一样。信号一糊，结论就站不住。

让内吞信号清晰可见

抗体和细胞膜上的靶点结合，只是故事的开始。接下来通常有三种走向：

• 停在膜上：抗体结合靶点后，既没被内吞也没脱落，安安静静挂在细胞表面。

• 循环回来：靶点-抗体复合物被内吞后，又通过 recycling 通路回到了细胞膜上。

• 真正内吞：复合物进入内体（endosome）→ 溶酶体（lysosome），一步步走向酸性区域。

对 ADC 来说，只有第三种才是"有效事件"——载荷要在酸性、富含蛋白酶的溶酶体环境里才被释放出来。

但传统荧光标记方案（无论二抗还是普通荧光染料）标记的都是抗体本身，它不区分抗体是站在膜上、还是躺在溶酶体里。于是所有结合事件都会被计入信号，内吞效率被高估，低内吞的分子更是很难被区分开。

为满足不同的抗体类型实验需求，ACROBiosystems百普赛斯推出pHintra™抗体标记试剂盒，提供更加灵活的直接标记方案。

pHintra™抗体标记试剂盒采用氨基共价标记策略，通过抗体表面的伯胺基团（-NH₂）将pH敏感荧光染料（Em660）高效偶联至抗体，仅需离心柱纯化即可获得标记抗体，可直接用于流式细胞术或细胞成像技术的抗体内吞检测。其染料本身的pH响应特性使标记抗体随受体介导的内吞进入内体/溶酶体等酸性胞内环境时，染料被激活并发出明亮荧光。只有真正完成内吞的抗体才会产生信号。

内吞效率

在 ADC 药物研发与抗体功能研究中，内吞效率与胞内转运过程是成药性评价的核心指标。

• 决定载荷能不能进细胞：不进细胞，再强的毒素也只是在膜外。

• 决定选择性：正常细胞若几乎不内吞，治疗窗口就会变宽。

• 是结构设计的实时反馈：连接子（linker）、偶联方式与 DAR、抗体亲和力、靶点选择——每一项改动，都会立刻反映在内吞曲线上。

• 不同实验阶段对内吞检测的需求并不一样：早期高通量筛选要的是快、省、通量高；而到了特殊物种或特殊亚型抗体的研究，考验的就变成了适配范围与标记稳定性。

常见的ADC内吞检测会出现哪些问题

① 二抗标记

需要经过固定、透膜、二抗孵育及多次洗涤等步骤，操作流程较长，多步处理也可能带来操作误差和信号损失。

②常规荧光染料直接标记

常规荧光染料在中性和酸性环境下均可发光，细胞表面结合与胞内内吞信号难以直接区分。对于低内吞样本，表面信号可能成为主要背景，降低检测区分度。

③ 毒素偶联 / 同位素示踪

适合高通量内吞筛选，但主要通过细胞毒性等功能性终点间接反映内吞，难以直接获得内吞信号及动态信息。

六个维度看pHintraTM产品特点

1. 无需二抗，直接标记目标抗体：pH敏感荧光染料直接共价标记至待测一抗，标记后分子量增量小，提高检测灵活性。

2. 高信噪比，低背景：酸性环境触发荧光，胞外中性环境下信号极低，显著降低背景噪声，提升低内吞效率样本的检测灵敏度。

3. 酸性环境响应，真实反映内吞：染料仅在内体/溶酶体等酸性区室增强荧光，信号与"真正进入细胞"的事件直接对应，而非膜结合或循环过程。

4. 操作快速，30分钟手动操作：仅需约30分钟手动操作完成抗体标记，实验全程约2.5小时；离心柱纯化即可获得标记抗体，无需复杂纯化步骤。

5. 全种属抗体通用：兼容多物种、多亚型IgG抗体，不受特殊物种或特殊亚型限制，适配更多实验场景。

6. 试剂一站式配齐：全套试剂标准化配置，省去方法开发环节，提供详细操作流程（DS文件）。

验证数据

• 标记抗体成功应用于内吞检测-FACS

Anti-Her2 Ab and Human IgG1 isotype control were labeled using pH-Sensitive Fluorescent Dye Antibody Labeling Kit (Cat. No. ALK-A004). SK-BR-3 cells were treated with Dye Labeled Anti-Her2 Ab and Dye Labeled Isotype Control separately at 37℃ for 4 hours, then analysis by Flow cytometric. APC signal was used to evaluate the internalization signal.

Anti-CD20 Ab and Human IgG1 isotype control were labeled using pH-Sensitive Fluorescent Dye Antibody Labeling Kit (Cat. No. ALK-A004). Raji cells were treated with Dye Labeled Anti-CD20 Ab and Dye Labeled Isotype Control separately at 37℃ for 4 hours, then analysis by Flow cytometric. APC signal was used to evaluate the internalization signal.

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