亮点推荐Nature | 糖原被E3连接酶直接泛素化——异常糖原的质量控制与自噬清除

撰文 | 阿童木

温馨提示：文末附编辑部短评

细胞内生物大分子的结构和功能需要受到严格监控。对于DNA和蛋白质而言，细胞已经建立了相对完善的质量控制系统：DNA损伤能够被识别并修复，错误折叠或聚集的蛋白则可通过泛素-蛋白酶体或自噬途径清除。然而，细胞如何监控糖原等其他重要生物大分子的“质量”，目前了解得要少得多。

糖原是动物体内储存葡萄糖的主要形式，由α(1,4)-糖苷键连接形成线性糖链，并通过α(1,6)-糖苷键产生大量分支。正常糖原通常每8–14个葡萄糖残基形成一个分支，这种高度分支结构使其保持良好的水溶性【1】。相反，当糖原分支不足时，较长的线性糖链容易形成难溶性的 多聚葡萄糖（ polyglucosan）并进一步聚集为多聚葡萄糖体（polyglucosan bodies）。其在脑、肝和肌肉中的积累会导致严重的病理改变，包括安德森病和成人多聚葡萄糖体病（APBD），这两种疾病是由糖原分支酶GBE1活性完全或部分丧失所致。其他相关疾病还包括多聚葡萄糖体肌病1型（PGBM1）以及 拉福拉病等【2】。

此前研究已经发现，多种E3泛素连接酶与多聚葡萄糖积累有关。例如，拉福拉病相关的malin-laforin复合物能够调控多种糖原相关蛋白，LUBAC组分HOIL-1和HOIP功能异常也会导致多聚葡萄糖积累【3】。但是，细胞究竟如何直接识别结构异常的糖原，以及泛素系统能否直接作用于糖原本身，仍缺乏清晰机制。

近日，英国MRC Laboratory of Molecular Biology的Felix Randow团队在Nature发表了题为 Quality control of glycogen through direct ubiquitylation by RNF213 的研究，发现E3泛素连接酶RNF213能够直接泛素化异常糖原多聚葡萄糖，并以此招募选择性自噬系统促进其清除，从而构成一种糖原质量控制机制。研究进一步发现，RNF213中的CBM20糖结合结构域并非简单负责招募RNF213至异常糖原，而是限制其错误攻击正常糖原。

RNF213此前主要因其在感染和脑血管疾病中的作用受到关注。研究发现，RNF213能够在细胞质细菌表面形成包被，并直接泛素化细菌脂多糖，从而将入侵细菌标记为选择性自噬底物【4】。由于RNF213含有一个常见于糖原和淀粉代谢酶的CBM20 碳水化合物结合结构域，作者推测RNF213介导的非蛋白泛素化也可能参与内源性糖原稳态。

作者首先在RNF213缺失小鼠中检验了RNF213是否调控多聚葡萄糖的积累。在12月龄Rnf213敲除小鼠的海马中，可以观察到大量抗淀粉酶消化的PAS阳性沉积，而且这一表型随年龄逐渐加重。进一步利用糖原特异性探针发现，异常多聚葡萄糖主要积累于小脑、脑桥、海马以及梨状皮层部分区域。这些多聚葡萄糖体与GFAP阳性的星形胶质细胞相关，并伴随反应性星形胶质细胞增生。携带催化活性缺失突变（C4462S）的小鼠表型与敲除小鼠一致，表明该功能依赖RNF213的E3泛素连接酶活性。此外，Rnf213⁻/⁻小鼠脑内糖原的未分支链更长，即积累分支不良的糖原，糖原代谢酶水平没有明显变化，这一结果与RNF213通过直接作用于多聚葡聚糖，而非通过间接调节糖原合成或降解通路进行质量控制的模型相一致。

为了进一步解析机制，作者建立了一套可控的细胞多聚葡萄糖模型。通过共同表达糖原蛋白（glycogenin）、缺失抑制性磷酸化位点的活化型糖原合酶GYS1以及糖原分支酶GBE1，细胞能够产生可被淀粉酶降解的正常糖原；而敲低GBE1后，则形成低分支、抗淀粉酶并容易沉淀的多聚葡萄糖。在这一体系中，RNF213明显富集于多聚葡萄糖表面，并伴随强烈的泛素信号；敲除RNF213后，这一泛素信号大幅降低。进一步实验显示，RNF213的AAA+ ATPase活性和RZ结构域介导的E3连接酶活性均是RNF213有效募集及多聚葡萄糖泛素化所必需的。

一个关键问题是，RNF213泛素化的究竟是多聚葡萄糖表面的蛋白质，还是糖原本身？作者分别利用能够切断酯键的羟胺和能够水解糖原的淀粉酶处理纯化的多聚葡萄糖。两种处理均可释放与多聚葡萄糖结合的泛素，而这一现象依赖RNF213。质谱分析进一步检测到共价连接葡萄糖残基的泛素产物。体外重构实验同样显示，纯化RNF213能够直接泛素化糖原来源的麦芽七糖，并且对多聚葡萄糖的泛素化效率明显高于正常糖原。这些结果表明，RNF213能够通过酯键直接将泛素连接到多聚葡萄糖中的葡萄糖残基上，从而将异常多糖本身转化为泛素化底物。

那么，RNF213又是如何区分正常糖原和异常多聚葡萄糖的？作者利用cryo-EM解析了RNF213与麦芽七糖结合的结构，发现RNF213的CBM20结构域能够直接结合线性寡糖，而破坏CBM20糖结合位点的W382A或Y434A突变，并不会阻止RNF213募集至多聚葡萄糖，说明CBM20并不是RNF213识别异常糖原所必需的经典底物结合结构域。相反，这些突变型RNF213开始募集至正常糖原，并对生理性糖原进行泛素化，最终促使其发生聚集。因此，作者认为CBM20的主要功能并不是把RNF213简单招募到多聚葡萄糖，而是限制RNF213对正常糖原的活性，从而防止错误的底物识别。

作者随后分析了另一类与多聚葡萄糖疾病相关的E3连接酶复合物LUBAC。遗传学分析显示，RNF213缺失会阻止LUBAC组分HOIP向多聚葡萄糖募集，而HOIL-1或HOIP缺失并不影响RNF213募集，表明RNF213总体位于LUBAC上游。不过，HOIL-1或HOIP缺失并未消除多聚葡聚糖上的总泛素或M1连接泛素信号，直接多聚葡聚糖泛素化也仍然存在，只是有所降低，提示除LUBAC外还有其他E3连接酶参与这一过程。

最后，作者研究了被RNF213泛素化后的多聚葡萄糖如何被清除。结果显示，泛素化多聚葡萄糖能够以RNF213依赖的方式募集SQSTM1/p62、TAX1BP1和Optineurin等自噬受体以及LC3。利用冷冻电子断层扫描技术，作者直接观察到多聚葡萄糖位于双层膜自噬体内部；活细胞成像进一步显示，RNF213包被的多聚葡聚糖被运输至酸化的LysoTracker阳性区室，与自噬溶酶体形成相一致。进一步分析表明，多聚葡聚糖进入自噬溶酶体后可发生至少部分降解。遗传敲除ATG5，或利用Bafilomycin A1和PIK-III抑制自噬，均可阻止多聚葡聚糖向溶酶体区室的转运。因此，RNF213对于多聚葡聚糖的直接泛素化及其后续自噬清除至关重要。

由此，该研究建立了一个RNF213介导异常糖原质量控制的机制模型：当正常高度分支的糖原转变为异常、低分支的 多聚葡萄糖后，RNF213能够选择性作用于这些异常糖原，并直接在其葡萄糖残基上添加泛素；泛素化多聚葡萄糖随后募集选择性自噬受体并进入自噬体，最终被送往自噬-溶酶体系统处理。

编辑部短评：

这项工作的价值，并不只是为RNF213增加了一个新的底物，而是把泛素依赖的质量控制框架进一步从蛋白质拓展到了内源性多糖。长期以来，异常糖原积累虽然是拉福拉病、APBD等疾病的核心病理特征，但细胞究竟如何判断一团糖原结构异常，以及如何将其从正常糖原池中选择性清除，一直缺少清晰的分子框架。

该研究通过遗传学、细胞重构、质谱、cryo-EM和cryo-ET等多层证据，将RNF213直接泛素化异常 多聚葡萄糖—募集选择性自噬—进入溶酶体处理串成了一条较为完整的质量控制通路，也进一步强化了近年来逐渐形成的认识：泛素修饰的底物范围并不局限于蛋白质，而可能参与更广泛的非蛋白生物分子稳态与质量控制（详见BioArt报道：）。尤其值得注意的是，CBM20结构域并未如预期那样充当简单的异常糖原识别模块，反而主要限制RNF213攻击正常糖原，提示RNF213的底物选择还依赖CBM20糖结合之外的未知机制。

不过，这篇文章仍留下几个关键问题：RNF213究竟通过什么结构特征识别多聚葡萄糖，为什么其缺失主要导致特定脑区和星形胶质细胞中的异常糖原积累，以及这一通路受损是否真正驱动神经功能障碍，目前都尚未得到直接证明。LUBAC及其他E3连接酶之间的分工也仍有待厘清。因此，这项研究更像是为“糖原质量控制”建立了一个新的机制框架，而不是已经完成了整个体系的闭环。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-11139-6

制版人： 十一

参考文献

1. Neoh, G. K. S. et al. Glycogen metabolism and structure: A review. Carbohydr. Polym. 346, 122631 (2024).

2. Hedberg-Oldfors, C. & Oldfors, A. Polyglucosan storage myopathies. Mol. Asp. Med. 46,85–100 (2015).

3. Mitra, S., Gumusgoz, E. & Minassian, B. A. Lafora disease: Current biology andtherapeutic approaches. Rev. Neurol. 178, 315–325 (2022).

4. Otten, E. G. et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature 594, 111–116 (2021).

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