《食品科学》：王娉研究员、武运教授等：短双歧杆菌靶向适配体荧光微球的制备及其在流式检测益生菌制品中的应用

益生菌作为人体微生态系统的核心功能组分，在调节肠道稳态、增强免疫屏障等方面发挥关键益生作用。近年来，益生菌产业呈现规模化、多菌株复配的发展趋势，双歧杆菌属与乳杆菌属（如鼠李糖乳酪杆菌、植物乳植杆菌等）的复合制剂已成为市场主流产品。然而，复合制剂在生产与储存过程中易受菌株间竞争抑制、环境胁迫等因素的影响，导致产品中靶标菌种（如短双歧杆菌）的活菌数量波动显著。且现有产品普遍仅标注出厂活菌添加量，未明确货架期内特定菌种的实际活菌水平。鉴于益生菌需达到106 CFU/mL（106 CFU/g）以上活菌数量后才能发挥益生效应，建立复杂菌群背景下短双歧杆菌的快速、特异性活菌定量方法，已成为保障益生菌产品质量与功能真实性的核心技术需求。

流式细胞术（FCM）作为一种高通量、多参数分析的技术，可在1～2 h内完成微生物活菌/死菌的快速区分，是益生菌质控领域的理想技术。然而，传统FCM依赖非特异性荧光染色，难以在复合制剂中实现特定菌种的精准识别与定量，且低浓度靶标菌的信号强度弱，易受杂菌背景干扰，检测灵敏度受限。核酸适配体（Apt）作为特异性分子识别工具，具备高亲和力、强特异性及易于修饰等特性，可实现复杂基质中靶标菌株的精准识别。在此基础上，通过将Apt与荧光聚苯乙烯微球共价偶联，既能借助微球的信号放大效应提升低浓度靶标菌的检测灵敏度，又可通过Apt的分子识别能力赋予FCM对菌种的特异性，为解决传统流式检测的技术瓶颈提供可行方案。

基于此，新疆农业大学食品科学与药学学院的郭宝姣、武运*，中国质量检验检测科学研究院的王娉*等等研究构建短双歧杆菌靶向Apt-荧光微球/FCM检测体系。通过优化Apt与荧光微球的偶联条件，实现Apt对靶标菌的高特异性识别与微球的信号放大协同；利用该体系突破传统FCM在复杂菌群中无法精准定量特定益生菌的局限，同时提升检测灵敏度与效率。本研究旨在为复合益生菌制品中短双歧杆菌的快速质控提供新型技术工具，并为其他特定益生菌的精准检测提供可借鉴的技术参考。

1 PS的粒径及荧光性能分析

如图2a所示，制备的PS呈规则球形，表面光滑无缺陷，粒径分布均匀。其中FM-PS表示未修饰链霉亲和素的PS；SA-FM-PS为修饰后的链霉亲和素PS。由图2a可知，与FM-PS相比，SA-FM-PS微球之间相互粘连，外表覆有一层外膜，证明链霉亲和素被成功修饰到微球表面。由图2b可知，修饰链霉亲和素后的荧光微球粒径略微增大。由图2c可知，所合成的链霉亲和素修饰PS在波长488 nm蓝光激发下能够发出明亮的绿色荧光，表明该微球所负载的荧光物质可以被488 nm波长的激发光有效激发。由图2d可知，微球在525 nm波长处有明显的荧光发射峰，这与FITC的荧光特性（在波长范围490～495 nm激发下，发出520～530 nm的绿色荧光）相印证，证明所合成的微球荧光性能良好，可作为荧光标记载体应用于后续实验。

2 短双歧杆菌Apt的亲和力分析

为明确Apt CCFM623与短双歧杆菌之间的相互作用强度，对Apt进行了亲和力测定，并通过量化Apt对靶标细菌的Kd，评估其识别并结合短双歧杆菌的能力。由 图3a可知，随着Apt浓度的增加，短双歧杆菌的荧光强度峰值逐渐向右偏移，表明Apt CCFM623与短双歧杆菌之间的相互作用逐渐增强；通过FlowJo v10.8.1软件分析不同Apt浓度下短双歧杆菌的平均荧光强度，在扣除背景荧光后得到荧光强度差值（ΔMFI），根据Apt浓度与ΔMFI之间的关系绘制饱和曲线，得到其Kd为（71.89±8.65）nmol/L，小于100 nmol/L（图3b），证明其亲和力强。

3 FM-PS结合Apt的优化及其验证

固定FM-PS的质量浓度为1 mg/mL，调节Apt的浓度、孵育温度、孵育时间对结合效率进行优化。如图4a所示，当Apt浓度为1 000 nmol/L时，与微球的结合效率均最高。如图4b所示，随着孵育温度的升高，短双歧杆菌Apt与FM-PS的结合效率呈逐渐增大趋势，当温度达到37 ℃时，Apt-荧光微球的结合效率增长趋势减缓，结合效率为62.95%。如图4c所示，随着孵育时间的延长，Apt-荧光微球的结合效率也呈逐渐增大趋势，当时间达到45 min时，Apt-荧光微球结合效率的增长趋势减缓，此时结合效率为61.27%。因此，Apt-荧光微球最优的结合条件为Apt浓度1 000 nmol/L、孵育温度37 ℃、孵育 时间45 min。

选择结合效率最高的条件进行Apt-微球合成，对其进行DNA测量和琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明，Apt-微球的上清液中DNA含量显著低于1 000 nmol/L Apt中的DNA含量（图4d），此结果与用全智能DNA含量测定仪所测结果（图4e）一致；继而使用SEM观察Apt-荧光微球的形貌，发现修饰Apt的荧光微球表面出现大量纳米级颗粒状凸起（图4f、g），整体形貌从光滑变为粗糙，证明Apt在FM-PS表面得到有效修饰。

4 Apt-FM-PS对靶标细菌的捕获

将洗涤后的复合物用100 µL PBS重悬，加入10 µL Apt标记荧光微球（1×106 beads/mL），轻柔吹吸混匀，避免复合物解离。样品准备完毕后使用流式细胞仪检测，并用FlowJo v10.8.1软件进行数据分析。结果表明，未结合Apt的荧光微球对短双歧杆菌的捕获能力低，其检测数量与纯微球的检测数量相当（图5a、b），而Apt-荧光微球对短双歧杆菌表现出显著的捕获性能，检测数量与前两者具有高度显著差异（图5c）。

5 Apt-FM-PS/FCM特异性定量方法的特异性分析

该方法的特异性分析结果如图6a、b所示，Apt-FM-PS对靶标菌株短双歧杆菌M-16V的捕获值显著高于其他对照菌株，组间差异高度显著（P＜0.000 1）。结果表明，所构建的Apt-FM-PS FCM检测方法对短双歧杆菌具有良好的特异性，可有效区分靶标菌株与其他益生菌，避免复杂微生物群落中非靶标菌株的干扰。

6 Apt-FM-PS/FCM特异性定量方法的灵敏度分析

为如图6c所示，随着菌液浓度从101 CFU/mL递增至108 CFU/mL，荧光峰的强度与峰面积均呈现逐渐增强趋势，证明Apt-FM-PS复合物对短双歧杆菌的结合数量随菌浓度升高而逐渐提高。基于不同浓度菌悬液的荧光强度定量数据，绘制荧光强度与短双歧杆菌浓度对数值的标准曲线（图6d）。结果显示，在102～108 CFU/mL 浓度范围内，荧光强度与短双歧杆菌浓度对数值呈现出极佳的线性关系，决定系数R2＝0.991 9，说明该方法对短双歧杆菌的检测限（LOD）为 102 CFU/mL，且在102～108 CFU/mL浓度范围内具有较高的线性相关性。

7 模拟样品检测结果

向无菌奶粉中分别加入低、中、高3 个浓度的靶标菌悬液，Apt-FM-PS微球捕获后使用FCM检测，并与平板计数法比较判断其定量可靠性。由表2可知，基于FCM的适配体微球检测方法与平板计数方法测得值相差较小。对该方法与平板计数的定量结果进行显著性分析检验，两种结果无明显差异（P＞0.05），表明方法定量准确可靠。本方法测得低、中、高浓度组回收率分别为98.67%、101.33%、98.00%，均在食品微生物检测方法学验证80%～120%的可接受范围内，表明该方法抗基质干扰能力良好。3 组RSD依次为2.44%、1.32%、2.45%，均小于3%，表明方法重复性好。

8 实际样品检测结果

为为验证所开发的方法在实际样本中检测短双歧杆菌的适用性，对7 种益生菌菌粉市售商品进行检测。样品经预处理和PI染色后，在FCM上进行分析。由表3可知，样品活菌检测结果均高于106 CFU/mL，7 种样品的检测值均符合产品标注值，表明该方法在实际样品中具有良好的检测稳定性，可准确反映产品中短双歧杆菌M-16V的真实活菌水平。

讨论与结论

复合益生菌产品中双歧杆菌的精准区分与定量至关重要，因其功能具有菌株特异性，且需达到106 CFU/mL（CFU/g）以上才能发挥益生效应。为了能更好地评价益生菌产品中双歧杆菌的活菌数量，需要对其进行准确识别与定量。在靶标识别方面，本实验选用核酸Apt作为短双歧杆菌的识别分子。因为相较于抗体，Apt的免疫原性低，能通过封闭处理减少复杂基质中杂质的非特异性干扰，在含乳糖等的益生菌样品中仍保持稳定识别。在定量方面，选用基于FCM的检测方法，该方法在研究活菌计数、特异性菌种定量及代谢活性评估等方面应用广泛，可快速实现高灵敏度、高通量检测。

近年来，基于FCM在益生菌检测分析中的应用日趋广泛。例如，Marcos-Fernández等使用流式细胞仪在多克隆抗细胞壁水解酶血清中特异性检测鼠李糖乳酪杆菌；陈卫通过筛选短双歧杆菌Apt并结合FCM实现了对短双歧杆菌的定量。与Apt-FM-PS方法相比，FAM-Apt方法虽然操作更简便、成本更低，但Apt-FM-PS方法可以通过荧光微球偶联大量Apt实现信号放大，提高检测灵敏度。在稳定性上，FAM-Apt相较于荧光微球易受光漂白，且单个Apt的构象受基质的影响较大。而荧光微球可保护Apt构象稳定，所以Apt-FM-PS方法的抗干扰能力与稳定性更优，更适配含复杂基质的样品中短双歧杆菌的精准定量。

在本研究中，Apt-FM-PS FCM检测法的LOD达102 CFU/mL，显著低于普通FCM直接计数法（103 CFU/mL），灵敏度优势突出。且该方法在102～108 CFU/mL范围内具有良好的线性相关性，而一般市售产品中益生菌添加量普遍在106 CFU/mL以上，故本方法的灵敏度检出限完全符合实际样品检测要求。此外，本方法全程时长小于2 h，传统平板计数法则需培养48～72 h才能对双歧杆菌进行计数，本方法的检测时间和效率较平板计数法提升超过20 倍。在实际样品检测时，本方法的RSD≤7.53%，定量准确性高且重复性好，但如果产品成分中的多糖类物质如麦芽糊精、多糖等含量较高时会影响微球的分散性，导致数据误差较大。因此在检测此类益生菌制品时应在稀释缓冲液中加入Tween 20以增加其分散程度。此外，不同批次的荧光微球间偶联效率可能存在一定差异，需进行严格的质控以保证定量准确性。

综上，本研究合成了粒径均一（2 µm）、荧光性能良好的FM-PS，并通过在微球表面连接核酸Apt成功制备出具有高特异性的Apt-FM-PS。性能验证结果表明，核酸Apt通过生物素-链霉亲和素的相互作用有效负载到了聚苯乙烯微球表面。利用Apt与靶标细菌的相容性设计了一种短双歧杆菌的FCM检测方法，并对该方法进行了特异性、灵敏度及实际样品检测。结果表明，基于FCM的Apt-荧光微球对短双歧杆菌具有高度特异性，该方法的LOD为102 CFU/mL，比普通FCM计数方法灵敏度更高（R2＝0.991 9）。且回收率为98.00%～101.33%，对实际样品检测的RSD≤7.53%，检测结果良好。这些结果表明，基于FCM的适配体-荧光微球检测方法可实现对复杂基质中短双歧杆菌高灵敏度、高特异性的快速定性和定量检测。该方法还可以通过改变所用的Apt检测其他细菌，在益生菌检测领域具有广阔的应用前景。总之，基于FCM的Apt-FM-PS方法有望为复合益生菌制品中短双歧杆菌的检测提供一种新型的研究思路，同时也为其他特定益生菌的精准检测提供了可借鉴的技术参考，对食品安全质量检测控制以及保证人类生命健康有着潜在的应用价值和社会意义。

作者简介

1

第一作者

郭宝姣 硕士研究生

新疆农业大学食品科学与药学学院硕士研究生，主要研究方向为食品微生物检测。

2

通信作者

武 运 教授

新疆农业大学食品科学与药学学院

武运，教授，主要研究方向为食品生物技术、食品营养与安全。

王 娉 研究员

中国质量检验检测科学研究院

王娉，研究员，主要研究方向为病原菌的检测分型。

引文格式：

郭宝姣, 曲天铭, 赵连慧, 等. 短双歧杆菌靶向适配体荧光微球的制备及其在流式检测益生菌制品中的应用[J]. 食品科学, 2026, 47(12): 356-364. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251223-192.

GUO Baojiao, QU Tianming, ZHAO Lianhui, et al. Preparation and application of aptamer-based fluorescent microspheres in flow cytometric detection of Bifidobacterium breve in probiotic products[J]. Food Science, 2026, 47(12): 356-364. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251223-192.

实习编辑：刘芯；编辑：阎一鸣；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

北京食品科学研究院、中国食品杂志社和全国糖酒会组委会将于2026年10月15-17日在江苏省南京市南京国际博览中心举办第115届全国糖酒会食品科技成果交流会。食品科技成果交流会期间举办食品科技成果展，本届科技成果展以我国当前食品产业科技需求为导向，重点邀请“十四五”以来获得国家和省部级重要科研项目支持产出的食品科技新成果、新技术、新产品参展，并针对企业技术需要开展精准对接服务。扫描下方二维码即可申请展位。

为进一步促进动物源食品科学理论的完善与创新，加速科研成果向实际生产力的转化，助力产业实现高质量、可持续发展，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、中国食品杂志社与海南大学、海南热带海洋学院、江西农业大学共同举办的“2026年动物源食品科学与人类健康研讨会”，将于2026年11月14-15日（11月13日报到）在中国 海南 海口召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）