Science丨TCRα链和β链以非对称模式协同调控抗原表位识别

撰文丨章台柳

生命系统常常面临一项挑战：如何利用数量有限的遗传编码基础单元，产生广泛的功能多样性。一种普遍的解决方式是异源二聚体受体的模块化设计，该模式可识别范围更广的信号，并精细调控细胞应答。B细胞、T细胞的抗原识别受体（即BCR、TCR）均属于异二聚体受体：BCR由重链、轻链构成；常规TCR由α 链、β链构成。这类受体的多样性主要来源于体细胞V (D) J重排：基因组可变区（V）、多样性区（D）、连接区（J）片段发生重排，并且在连接位点随机插入、删除核苷酸。该过程产生约1017种BCR重链和1011种TCR β链。这些链与配对伴侣随机组合进一步放大多样性，αβ‑TCR组合的理论下限约为2×1019种。由此可见，链配对是塑造功能性受体库的主导因素，但该过程目前研究仍较为匮乏。

BCR重链是决定B细胞特异性的主要因素，骆驼科动物就是典型例子：该物种大部分抗体仅由重链构成。传统BCR重链可以和多种轻链配对，同时仍保留抗原结合能力——这一特性已被应用于抗体工程研究。但这种配对灵活性并非没有限度，功能性抗体往往存在配对限制，该现象被称为轻链一致性。与BCR重链占据主导地位不同， TCR两条链对抗原识别的贡献更为均衡，α链与β链均会和肽‑MHC复合物（pMHC）产生关键相互作用。但另一方面，免疫应答中常常存在“公共TCRβ链”；同时体外实验显示，固定某一条TCR链，可以和多种改造后的配对链组合，提升功能亲合力。上述证据说明TCR同样具备一定的混杂配对能力。

近日，来自美国布兰戴斯大学福瑞德·哈金森癌症中心的Paul G. Thomas 和Anastasia A. Minervina团队合作在Science杂志上发表文章Uneven TCR chain pairing constraints govern epitope recognition，通过强制将单条TCR链与数十万种配对伴侣组合，系统探究TCR链之间的配对约束条件。尽管绝大多数链均可稳定配对，但能够保留表位特异性的配对十分稀少，且个体差异极大，可兼容配对伴侣的出现频率介于约10%至低于0.1%之间。借助该实验方法，针对10种表位鉴定出70000个以上表位特异性TCR。研究阐明了TCR两条链各自的独特作用，揭示仅依靠单链数据存在的局限性，并为优化TCR‑肽‑主要组织相容性复合体的特异性推断，提供一套实验与分析框架。

为了定量评估TCR链配对是否影响表位识别，研究人员建立了一套体外试验方法。将编码外源特异性TCR链（α链或β链）的RNA导入健康供体外周血单个核细胞（PBMC），获得一批双重特异性T细胞，即同时拥有内源αβ‑TCR，以及由内源TCR链与外源TCR链配对形成的嵌合TCR。同时使用siRNA靶向内源α链或β链的恒定区，选择性降低内源TCR的表达，不影响经过密码子优化的外源‑TCR RNA。这样减少不同TCR竞争有限的CD3分子，提升检测效率。为验证嵌合TCR的细胞表面表达，选取5条外源‑TCR链（2条α链、3条β链），使用对应的抗V区抗体染色检测。所有被测外源‑TCR链均可在94%以上CD4⁺与CD8⁺细胞表面检测到嵌合TCR。这说明实现TCR稳定表达层面，链配对几乎不存在严格约束。该结果与以往配对αβ‑TCR受体库的计算分析结论一致：链配对大多是相互独立的。将靶向黄热病病毒（TCRαLLW）和流感病毒（TCRβGIL）的两个免疫优势表位的TCR链导入4位健康受试者的PBMC，检测细胞产生表位特异性TCR的能力。导入外源-TCR链后，所有供体样本中pMHC四聚体阳性细胞数量均上升，而无关对照表位的阳性比例并没有升高。证明天然T细胞库中存在大量可与单条外源‑TCR链配对、组装成表位特异性受体的伴侣链。对四聚体阳性的嵌合TCR受体库测序，一共鉴定得到3470种不同、可与TCRβGIL兼容配对的TCRα链，以及超过21000种可与TCRαLLW兼容配对的TCRβ链。虽然部分嵌合TCR可以识别目标表位，但绝大多数（>98%）依然无法实现抗原结合。说明能够成功配对的伴侣链自身，也收到严格的序列约束。对比四聚体阳性（配对兼容）与四聚体阴性（配对不兼容）两组伴侣链的序列。四聚体阳性、识别A02‑LLW的TCRβ链，在CDR3长度上明显偏13 个氨基酸，并且优先使用V基因家族TRBV27、TRBV4、TRBV9，以及J基因TRBJ2‑7。四聚体阳性、识别A02‑GIL的TCRα链富集V基因家族TRAV27，以及J基因TRAJ42、TRAJ37。进一步分析显示，不同供体之间，四聚体阳性嵌合TCR受体库具有可重复性，供体自身HLA单倍型不对单链受体库造成明显影响。将嵌合TCR与公共数据库报道的天然抗原暴露产生的TCR进行比对，发现嵌合TCR受体库遵循与天然TCR完全相同的规律，能够很好复现体内天然存在的表位特异性序列。

为验证实验体系的双向适用性，研究人员开展反向筛选，改用TCRβLLW和TCRαGIL作为新的外源-TCR链，来研究反向条件下可配对伴侣链的多样性。反向实验后四聚体阳性细胞频率仅为：A02‑GIL 0.045%，A02‑LLW 0.19%，说明可兼容的伴侣链占比很低。提示A02‑GIL对应的β链、A02‑LLW对应的α链受到极强序列约束。分析序列发现，反向实验不仅得到与原始原型链高度近似的序列，也发现大量亚变异体以及序列差异极大的伴侣链。不同TCR链对表位识别的贡献并不均等。对于A02‑GIL与A02‑LLW两种表位：一条具备高度进化抗原识别能力的TCR链，可以搭配种类繁多的互补伴侣链；与之相反，伴侣链自身又需要满足特定序列约束，才能维持整套TCR的表位特异性。此外，仅使用公共数据库以及外源- TCR阴性样本对有监督机器学习算法进行训练，其区分阳性/阴性样本效果较差。而将外源- TCR实验标记的阳性、阴性样本一同纳入训练集，模型性能显著提升。说明这套高密度、信息丰富的嵌合受体库，是优化TCR特异性预测的优质资源。

对四聚体阳性与阴性、序列高度相似的伴侣链进行序列分析，发现单一位点发生氨基酸替换就会区分阳性、阴性伴侣链。TCRβLLW突变集中在CDR3第5‑9位氨基酸，且富集带电氨基酸；TCRαGIL突变集中在第 4 位。提示表位特异性TCR序列上氨基酸替换不是随机发生，反映TCR‑pMHC复合物内部的直接接触位点。为了理解单个氨基酸改变如何破坏TCR‑pMHC，研究人员基于TCRdock（AlphaFold3）建模构建结构模型，以 A02‑TCRβ2GIL第4位P→F突变作为代表。建模显示突变会改变CDR3α环构象，引入额外非极性原子，破坏TCR‑pMHC界面的极性相互作用。此外，单氨基酸阴性TCR对绝大多数肽段突变体完全无应答，但个别对突变肽恢复应答，证明肽段上单个特定氨基酸突变可以挽救TCR识别。使用16条序列和天然受体库相似度各不相同的TCR测试133种LLW、GIL肽变体，从而对交叉反应谱进行探究。所有TCR均可识别对应的野生型肽，部分变体肽会引起更强应答。全部LLW特异性TCR大多可耐受6、7、8位突变；而GIL特异性TCR几乎对第1位全部突变都可以识别。TCR识别肽段变体的数量，与WT野生型肽的应答强度之间呈正相关。说明WT表位肽的应答强度，决定了该TCR交叉反应的广度。天然来源TCR对野生型肽本就具备更高应答，因此它们通常表现出更宽的交叉反应谱。

将TCR伴侣链的混杂度定义为：仍保留抗原结合能力的伴侣链占全部伴侣链的比例。黏膜相关恒定 T 细胞（MAIT）、恒定自然杀伤 T 细胞（iNKT）均使用高度受限（“恒定型”）的TCRα链，对其TCR混杂性进行探究。结果显示，表位特异性TCR配对的混杂度可以跨好几个数量级，约0.01%-10%。不同TCR之间普遍存在巨大差异，与可兼容伴侣链受到的序列约束有关。TCR链的混杂度与其对表位肽结合的贡献大小存在关联。同时，研究人员证明在本实验体系中，导入一条外源‑TCR链，就可以把单一TCR扩展为一组识别该表位变体的TCR集合。这种方法实现了TCR重排组合的高通量发掘，原本需要对数万、数百万个体采样才能找到的TCR，现在可以直接获得。

总的来说，这项研究揭示了TCRα、β链以非对称模式协同发挥功能；针对不同抗原表位，配对约束条件差异巨大，对应的抗原识别能力跨度可达三个数量级。从序列与结构层面解析这套约束规律，是阐明“TCR链配对如何促进靶抗原识别”的关键，也是仅依靠氨基酸序列预测TCR抗原特异性的必要前提。研究有助于优化计算模型，推动面向诊断与临床治疗的预测算法进一步发展。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adx3863

制版人： 十一

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