离心、微滤、深层过滤：单抗收获技术怎么选？

做抗体纯化这行，大家聊得最多的是什么？Protein A层析、病毒灭活、抛光步骤，对吧？这些都是下游工艺里最核心、最值钱的环节。

但你有没有想过一个问题：在细胞培养罐里收获的料液，里面全是活细胞、死细胞、细胞碎片、HCP、DNA，还有各种培养基成分。这么脏的料，是怎么变成能直接上Protein A柱的澄清液的？

这就是收获与澄清——下游工艺的第一道关口。很多人觉得这一步不就是离心加过滤吗，有什么好聊的？但实际上，这一步做得好不好，直接决定了后面所有层析步骤的寿命和效果。

最近重读了《Process Scale Purification of Antibodies》第三版第三章，作者是Abhinav Shukla和Dustin Costello。这一章把收获与澄清的各种技术讲得非常透彻，从离心到微滤，从深层过滤到絮凝，还有一次性和连续制造的新趋势。

今天就把这一章的核心内容提炼出来，和大家聊聊单抗下游的第一道关，到底是怎么回事。

一、为什么收获与澄清这么重要？

先给大家一个概念：现在的哺乳动物细胞培养，细胞密度能做到多少？

30×10⁶ cells/mL。这是什么概念？十年前，主流生产工艺的细胞密度大概也就5-10×10⁶ cells/mL。现在翻了两三倍。

细胞密度上去了，单位体积的产量上去了，但带来的问题也很现实：料液更脏了。

细胞培养结束的时候，料液里有什么？活细胞、死细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白（HCP）、宿主细胞DNA、蛋白水解酶、脂质、代谢废物，还有各种各样的培养基成分。

这些杂质如果不提前去掉，会怎么样？

第一，细胞破碎会释放更多杂质。离心的时候如果剪切力太大，或者排渣的时候把细胞打碎了，HCP和DNA就会大量释放出来。后面Protein A柱要处理的杂质就多了，柱子寿命变短，纯度也受影响。

第二，颗粒会堵柱子。细胞碎片、聚集体这些颗粒，如果没过滤干净，进到Protein A柱里，会堵树脂孔道，流速越来越慢，柱压越来越高，最后只能提前洗柱或者换柱。一根Protein A柱多少钱？几万美元。堵坏了真的心疼。

第三，蛋白酶会降解产品。细胞破碎之后释放的蛋白水解酶，会把抗体切碎，影响收率和产品质量。

所以收获与澄清这一步，看起来只是粗分离，但它是整个下游工艺的基础。这一步没做好，后面再怎么调层析条件都是事倍功半。

二、离心：最传统也最主流的方法

说到收获，第一个想到的就是离心。碟片式离心机（Disc-stack Centrifuge）是目前大规模单抗生产的绝对主力。

原理很简单：利用离心力，把细胞和细胞碎片从重的液体里甩出去。连续进料，连续出澄清液，沉渣定期排出去。

但实际做工艺的时候，没那么简单。有几个参数非常关键：

第一，流速。流速越快，处理量越大，但澄清效果越差——细胞来不及沉下去就跟着上清走了。流速慢一点，澄清效果好，但处理量上不去。这里有个trade-off。

第二，排渣方式。早期的离心机是间歇排渣——攒够了一整碗沉渣，一次性排出去。但排渣那一下冲击力很大，很容易把已经沉下去的细胞再打碎，释放HCP和DNA。

现在主流用的是连续排渣，或者说低频排渣。排渣频率调得高一点，每次排的量少一点，细胞破碎就少得多。但这里也有个平衡：排得太频繁，收率会降——因为一部分澄清液跟着沉渣一起排出去了。

第三，剪切力。离心机内部的流道设计很讲究。流道太窄，或者流速太快，剪切力就大，容易把细胞打碎。现在好一点的离心机，都在尽量优化流道，降低剪切。

离心的优点是什么？处理量大，可靠性高，成熟稳定。几千升级别的反应器，离心都是首选。

缺点呢？设备贵，占地方，要做CIP/SIP验证。而且离心机是动设备，有转动部件，维护成本不低。

最近几年，一次性离心机慢慢起来了。比如Cytiva的kSep、Thermo的DynaSpin、Alfa Laval的CultureOne。这些一次性离心机的转鼓是一次性的，用完就扔，不用清洗验证。特别适合临床批次、小批量生产，还有一次性生产车间。

三、微滤：切向流的艺术

除了离心，另一个路线是微滤——用膜直接过滤掉细胞和碎片。

但这里有个问题：如果是死端过滤，料液里的颗粒很快就把膜堵死了。所以微滤用的是切向流过滤（TFF）——料液沿着膜表面高速流过，颗粒被水流冲走，不会沉积在膜面上。只有小分子的液体和蛋白穿过去。

微滤的孔径一般是0.2-0.45μm，比细胞小很多，所以细胞和大碎片都被拦住了，只有抗体这种小分子能透过去。

听起来很美好对吧？但实际用的时候，有个大问题：浓差极化和膜污染。

什么意思？就是料液里的蛋白和颗粒，会在膜表面形成一层凝胶层。这层东西会越积越厚，导致通量越来越低，最后根本跑不动。

为了解决这个问题，大家想了很多办法：提高切向流速、周期性反冲、用不对称膜。但本质上，微滤还是逃不过污染这个问题。

所以现在行业里的主流选择，还是离心为主，微滤用得相对少。微滤更适合那些细胞密度特别高、或者对剪切特别敏感的工艺。一般情况下，离心加深层过滤的组合，性价比更高。

四、深层过滤：被低估的澄清主力

如果说离心是收获的主力，那深层过滤就是澄清的主力。

什么是深层过滤？它不是一张筛子，而是一层厚厚的多孔介质——通常是纤维素、硅藻土、珍珠岩这些东西压在一起的滤板。

它的过滤机制不是简单的孔径大小筛颗粒，而是好几种机制一起作用：

-深度筛分：颗粒钻进滤层里面的曲折通道，被卡住

-吸附作用：滤料表面带电荷，把带相反电荷的颗粒吸附住

-惯性碰撞：颗粒跟着水流跑，撞到滤料纤维上就粘住了

因为是深层过滤，所以颗粒不是只被拦在表面，而是藏在整个滤层里面。这就意味着它的载量很大——同样面积的滤器，能处理的料液比普通微滤多得多。

现在的深层滤器一般是两层结构：上层粗一点，先拦大颗粒；下层细一点，拦小颗粒。串联起来用，效果最好。

而且现在的深层滤器越来越厉害，已经不只是单纯的过滤了。有些滤器里加了带电荷的基团，或者混了AEX（阴离子交换）的介质，能在过滤的同时，顺便去掉一部分HCP和DNA。比如3M的Emphaze系列，就是把AEX水凝胶整合到深层滤器里，一步过滤，既澄清又除杂。

还有一个很实用的点：深层滤器是一次性的。用完就扔，不用清洗验证，特别适合一次性生产车间。现在大多数一次性生产设施，收获这一步根本不用离心机，直接深层过滤就搞定了。

五、絮凝和其他新技术

除了上面说的这些主流技术，还有一些辅助技术也值得了解。

絮凝就是其中一个思路。简单说，就是往料液里加絮凝剂，让小颗粒聚集成大颗粒，这样不管是离心还是过滤，都好处理多了。

常用的絮凝剂有哪些？壳聚糖——一种食品级的天然高分子，安全无毒。还有氯化钙加磷酸钾的组合，能在料液里形成磷酸钙沉淀，顺便把杂质裹进去。阳离子聚合物比如pDADMAC、PEI，也都在用。

絮凝的好处是什么？它不只是帮助分离，还能顺便去掉一部分HCP和DNA。因为杂质和絮凝剂结合在一起，一起被去掉了。这样后面层析步骤的压力就小了。

不过絮凝也有个问题：加了絮凝剂，后面要验证残留。毕竟是往药里加东西，要证明它没有残留、不影响产品质量，这个验证成本不低。所以絮凝一般用在那些杂质特别多、传统方法搞不定的工艺里。

还有一个很有想法但实际用得不多的技术，叫扩张床吸附层析（EBA）。它的思路是：跳过单独的收获和澄清，直接把细胞培养上清过层析柱，一边过滤一边捕获产品。理论上很美好——一步到位，省了好多步骤。但实际做起来问题很多：床层不均匀、颗粒分布乱、放大难。这么多年了，真正商业化应用的案例很少。

六、未来趋势：一次性和连续制造

最后聊聊趋势。收获与澄清这一步，未来会往哪走？

第一个大趋势是一次性技术的普及。

现在新建的生产车间，越来越多是一次性的。反应器是一次性的，层析柱是一次性的，连离心收获都有一次性的方案。为什么？因为不用清洗验证，省了大量时间和成本，换产品也快。

收获这一步也是一样。以前离心是不锈钢的，现在有了kSep、DynaSpin这些一次性离心机。深层滤器本来就是一次性的，现在更是主流。以后大概率会是：大规模生产可能还用不锈钢离心，中小规模、临床批次，基本都走一次性路线了。

第二个大趋势是连续制造。

现在的生物药生产，都是批次模式——一批一批做，做完一批再做下一批。但连续制造不一样，料液是连续不断地进来，产品连续不断地出去。

连续制造对收获的要求很高。因为不能停下来，所以收获必须是连续的、稳定的。ATF（交替切向过滤）、PCC（周期逆流层析）这些技术，都是为连续生产服务的。

连续制造的好处是什么？设备更小、占地面积更少、生产效率更高、质量更稳定。现在整个行业都在往这个方向走，只是现在还处在早期，大规模商业化应用还要等几年。

写在最后：第一关的重要性，往往被低估

做下游工艺的人，眼睛都盯着后面的层析步骤——Protein A柱载量多少、回收率多少、HCP降到多少。这些当然重要，但前面的收获与澄清，才是整个工艺的地基。

地基打不好，后面再怎么折腾都是白搭。料液澄清度差一点，Protein A柱的寿命就短一截；HCP和DNA多一点，抛光步骤的压力就大一圈。

很多人觉得收获澄清就是粗分离，没技术含量。但实际上，这里面的门道一点都不少：离心的参数怎么调、深层滤器怎么选、絮凝剂怎么加、一次性和不锈钢怎么选……每一个选择都影响最终的收率和成本。

这一章非常推荐做下游工艺的同行认真读一遍。不是要记住那些公式和参数，而是理解每一种技术的优缺点、适用场景，以及背后的逻辑。知道什么时候该用什么方法，比记住一堆参数有用得多。

本文基于《Process Scale Purification of Antibodies》第三版第三章《Harvest and Recovery of Monoclonal Antibodies: Cell Removal and Clarification》（作者：Abhinav A. Shukla, Dustin Costello）内容提炼整理。

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