Protein A太贵？这些老技术正在悄悄改写规则

做抗体纯化的同行，都知道Protein A是金标准。捕获一步到位，纯度高、收率好、平台通用。

但Protein A也有个问题——贵。

一升Protein A树脂，几千到上万美元。一根层析柱装下来，十几万就出去了。而且树脂有寿命，循环个几十上百次就得换。对于产量大、成本敏感的产品，这是一笔不小的开销。

所以行业里一直在找：有没有更便宜的办法，能替代或者部分替代Protein A？

最近读了《Process Scale Purification of Antibodies》第三版第四章，作者是百时美施贵宝（BMS）的Nripen Singh和Srinivas Chollangi。这一章专门讲下一代澄清技术——沉淀、絮凝、吸附型深层过滤这些老技术的新用法。看完挺有启发的。

今天就把这一章的核心内容提炼出来，和大家聊聊：除了Protein A，我们还有哪些选择？

一、为什么要找Protein A的替代？

先说说为什么大家对Protein A又爱又恨。

爱的地方不用说了：捕获效率高，一步就能把抗体从细胞培养上清里拉出来，纯度95%以上，后面跟两步抛光就完事了。整个行业都在用，工艺平台成熟，监管也认可。

但恨的地方也很现实：

第一，成本高。Protein A树脂是按毫升卖的，一升几千美元起步。而且这东西不是买了就一劳永逸——CIP清洗、反复使用，寿命有限。对于年产能几百公斤的大产品，Protein A树脂的折旧成本占下游总成本的比例非常高。

第二，HCP和DNA的搭便车问题。很多人不知道，HCP和DNA不是只在进料里有——它们会和Protein A配基非特异性结合，然后跟着抗体一起被低pH洗脱出来。也就是说，你花大价钱过了Protein A柱，出来的料里还是有不少HCP和DNA，后面抛光步骤还得接着去。

第三，染色质杂质。细胞破碎之后释放的染色质、组蛋白这些东西，特别麻烦。它们会和抗体形成复合物，Protein A也分不开。最后这些杂质进到制剂里，会影响产品质量和免疫原性。

所以行业里一直在琢磨：有没有更便宜的办法，在Protein A之前就把这些杂质去掉一部分？或者，有没有可能用沉淀、絮凝这些更便宜的技术，部分替代Protein A的功能？

二、沉淀法：老技术新用

沉淀法不是什么新技术。做生化的，谁没做过硫酸铵沉淀？但最近这些年，沉淀法又被捡起来重新研究了——因为它真的便宜。

这一章里讲了好几种沉淀方法，各有各的特点：

酸沉淀：把pH降到4-5.5，用醋酸、磷酸或者柠檬酸。原理很简单——降低杂蛋白的溶解度，让它们沉淀出来，抗体留在上清里。效果怎么样？HCP能降低1-2个log，DNA能降低1-3个log。

但酸沉淀有个问题：pH太低会损伤抗体，收率会降。而且低pH条件下，有些杂质反而溶得更好了。所以酸沉淀一般不是单独用，而是作为前处理步骤。

辛酸沉淀这个方法有意思。辛酸是一种8碳的脂肪酸，加进去之后，它会和杂蛋白结合，把杂蛋白的三级结构破坏掉，让杂蛋白沉淀。而抗体因为带的电荷多，保持溶解状态，留在上清里。

更妙的是，辛酸还能顺便灭活脂包膜病毒——效果能到3个log以上。相当于一步搞定澄清、除杂、病毒灭活三件事。成本比层析便宜多了。

PEG沉淀的原理是体积排阻——PEG分子把水抢走，蛋白的溶解度下降，大分子先沉淀。抗体分子大，先沉下来；小的HCP留在上清里。这样一来，不仅能分离抗体和杂蛋白，还能顺便去掉高分子量的聚集体。一举两得。

冷乙醇沉淀（CEP）是最老牌的了，二战的时候就用来做IVIG。最近又被重新翻出来研究——能不能用它替代Protein A？思路是：先冷乙醇沉淀粗提，再跟抛光步骤组合，整个流程不用Protein A柱。

这些沉淀法的共同优点是什么？便宜。不用买贵的树脂，不用装层析柱，就是加试剂、搅拌、离心或者过滤。成本比层析低一个数量级。

缺点呢？选择性差。沉淀法不像Protein A那样特异性地抓抗体，它是一刀切——要么把抗体沉下来，要么把杂质沉下来，精度不够。所以一般不能完全替代Protein A，只能作为前处理，帮着去掉一部分杂质，减轻后面层析步骤的压力。

三、絮凝：让杂质抱团的艺术

絮凝和沉淀有点像，但思路不一样。

沉淀是让杂质自己沉下来，絮凝是加一种叫絮凝剂的高分子聚合物，让小颗粒互相抱团，变成大颗粒，然后就好分离了。

就像下雨天，小雨滴本来很小，飘在空气中落不下来；但如果有凝结核，小水滴就会抱成大水滴，变成雨落下来。絮凝剂就是那个凝结核。

絮凝剂分好几种：

阴离子絮凝剂：带负电的聚合物。它的思路是——把pH调到比抗体等电点低的地方，让抗体带正电，然后带负电的絮凝剂就把抗体抓下来，沉淀。然后再调pH把抗体重新溶出来。

但这个方法有个问题：现在的细胞培养上清，电导率越来越高（15-20 mS/cm），高离子强度会屏蔽电荷，絮凝效果就大打折扣。所以阴离子絮凝剂现在用得不多了。

阳离子絮凝剂：带正电的聚合物。思路反过来——中性pH下，杂质（HCP、DNA、细胞碎片）带负电，带正电的絮凝剂把它们抓下来沉淀，抗体留在上清里。

这个思路更实用。比如pDADMAC（聚二烯丙基二甲基氯化铵），就是一种常用的阳离子絮凝剂。效果怎么样？HCP能去掉80%以上，DNA能去掉99%以上。而且抗体收率能保持在90%以上。

还有个更新的方向，叫多模式絮凝剂或者智能聚合物。它不只有静电作用，还有疏水作用，好几种作用力一起上。

比如BMS他们研究的SmP（Smart Polymer），效果比传统絮凝剂好得多。处理之后的HCP水平，居然能降到跟Protein A洗脱液差不多的水平。这就很厉害了——相当于用絮凝这一步，就达到了Protein A的除杂效果。

絮凝的好处是什么？便宜、快、处理量大。加进去搅一搅，杂质就抱团沉下来了，离心或者过滤就能去掉。成本比层析低得多。

但絮凝也有个大问题：残留验证。你往料液里加了化学试剂，就得证明它没有残留在最终产品里。这个验证成本不低——要开发检测方法，要证明残留量在安全范围内。这也是为什么絮凝技术研究了这么多年，还没有大规模用在商业化生产上。

四、吸附型深层滤器：过滤除杂一步到位

前面说的沉淀和絮凝，都要加化学试剂，都有残留验证的问题。那有没有不用加试剂的办法？

有——吸附型深层滤器。

普通的深层滤器，就是靠孔径大小筛颗粒，对吧？但新一代的深层滤器，里面加了带电荷的基团，或者混了离子交换介质，不仅能过滤颗粒，还能吸附杂质。

最典型的就是3M的Emphaze系列。它是把AEX（阴离子交换）水凝胶整合到深层滤器里。效果怎么样？

过一遍这种滤器，澄清度提升了，HCP去掉了，DNA也去掉了——DNA能降低3.5个log，HCP降低十几倍。相当于一步过滤，同时做了澄清、阴离子交换除杂两件事。

更厉害的是，这种吸附型深层滤器还能去病毒。比如X-MuLV，能做到5个log以上的病毒清除。机制是静电吸附加上疏水作用。

这意味着什么？以前要过Protein A柱 + AEX抛光柱 + 病毒过滤膜，三步。现在可能两步就够了——吸附型深层滤器 + 病毒过滤膜。少了一步层析柱，成本降一大截。

而且吸附型深层滤器是一次性的，用完就扔，不用清洗验证，特别适合一次性生产车间。现在很多新建的一次性生产设施，收获澄清这一步，都开始用这种新型滤器了。

五、现实挑战：为什么这些好技术还没大规模用起来？

你可能会问：既然这些技术这么好，为什么行业里还都是Protein A？

因为理想很丰满，现实很骨感。

第一个问题：验证成本高。不管是沉淀、絮凝还是新型滤器，只要你改了工艺，就要做全套验证——工艺验证、安全性验证、法规申报。这个成本和时间投入是很大的。

特别是絮凝剂、沉淀剂这些化学试剂，你得证明它没有残留、不影响产品质量、没有毒性。这个验证做下来，可能要花好几年。对于一个已经上市的产品，改工艺的动力不大。

第二个问题：通用性不够。Protein A为什么成了金标准？因为它平台化——大部分IgG都能用同一套工艺。但沉淀和絮凝呢？不同的抗体，等电点不一样，电荷不一样，最优条件就不一样。每个产品都要重新开发工艺，平台化程度低。

第三个问题：法规接受度。Protein A用了几十年了，监管部门都认可了。新的技术、新的工艺路线，监管那边还要慢慢建立共识。你提交一个用沉淀法做的工艺，审评老师可能都没见过，得来回沟通，这个时间成本很高。

第四个问题：收率和质量的平衡。这些技术除杂效果好，但会不会损失抗体收率？会不会影响产品的关键质量属性？这些都要一点点验证。很多时候，为了提高一点除杂效果，牺牲了收率，算下来反而不划算。

所以现在的情况是：这些技术都在实验室和中试阶段研究得很热闹，真正大规模商业化用的还不多。但方向是明确的——成本压力越来越大，迟早会推动这些技术慢慢用起来。

写在最后：技术永远在进化

做抗体纯化这行，Protein A是现在的金标准，但它不会永远是。

就像当年离子交换被Protein A取代一样，未来某一天，可能会有更便宜、更高效的技术，把Protein A也替代掉。沉淀、絮凝、吸附型深层过滤这些技术，现在看起来还不太成熟，但都是方向。

对于做工艺开发的人来说，眼界要宽一点——不要只盯着层析柱那点事。老技术新用，有时候能解决大问题。成本压力大的时候，花最少的钱办最多的事，才是真本事。

这一章非常推荐做下游工艺的同行读一读。不是要你马上就把Protein A换了，而是了解一下行业里都在研究什么、未来的方向是什么。知道我们现在站在哪里，才知道要往哪里走。

本文基于《Process Scale Purification of Antibodies》第三版第四章《Next-Generation Clarification Technologies for the Downstream Processing of Antibodies》（作者：Nripen Singh, Srinivas Chollangi, Bristol-Myers Squibb）内容提炼整理。

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