《Bioact. Mater.》华科张明昌/武大蔡杰团队：多功能复合水凝胶抗菌协同趋化内源性干细胞促进细菌性角膜炎损伤修复

近期，华中科技大学同济医学院附属协和医院张明昌团队和武汉大学化学与分子科学学院蔡杰团队在科爱创办的期刊Bioactive Materials上联合发表文章：多功能复合水凝胶抗菌协同趋化内源性干细胞促进细菌性角膜炎损伤修复。通过开发一种多功能水凝胶平台，将抗菌作用与内源性角膜组织再生结合，提出了一种治疗细菌性角膜炎的变革性方法。QUDCS的强效抗菌特性协同SDF-1再生信号解决了当前临床上绿脓杆菌性角膜炎面临的感染控制和组织修复双重挑战。该体系将“抗菌—干细胞招募”结合，为感染性角膜疾病提供从单一抗菌向整合治疗的新策略。

01

研究内容简介

目前由耐药菌引起的细菌感染已是全球公共卫生面临的严峻挑战，发展新型具有抗菌作用且不易产生耐药性的抗菌材料势在必行。壳聚糖——一种经甲壳素去乙酰化获得的阳离子多糖，通过静电破坏细菌膜显示出固有的抗菌活性。绿脓杆菌感染性角膜炎是一种极具破坏性的角膜感染性疾病。其起病急、发展迅速，感染早期即出现大量炎性细胞浸润，极易导致角膜穿孔。这一临床现实强调了迫切需要创新的治疗方法，同时克服生物膜耐药性和促进组织再生。生物材料工程的最新进展，包括抗菌肽、纳米颗粒和壳聚糖等，通过整合抗菌和再生平台为解决这些挑战提供了变革性的机会。基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是目前已知的对干细胞动员趋化作用最强的因子之一。因此我们提出科学假说：利用均相合成反应构建水凝胶SDF-1/QUDCS/OD，该水凝胶系统可以原位成型覆盖角膜缺损部位避免角膜穿孔，QUDCS的高阳离子密度静电破坏绿脓杆菌生物膜并穿透生物膜基质发挥抗菌作用；缓释的SDF-1建立了持续的趋化梯度，通过SDF-1/CXCR4轴激活Wnt/β-catenin信号通路吸引角膜缘干细胞（LESCs和LNCs）至炎症缺损部位定植、分化，修复缺损角膜，最终达到治疗绿脓杆菌感染性角膜炎并恢复角膜结构功能的效果。

一、假说及机制示意图

该水凝胶由季铵化超高脱乙酰壳聚糖（QUDCS）和氧化葡聚糖（OD）通过希夫碱反应形成，包封SDF-1。病损区快速原位成型后，水凝胶提供机械支撑，防止角膜穿孔，同时通过静电破坏细菌膜和穿透生物膜发挥抗菌作用。持续的SDF-1释放建立了趋化梯度，从角膜缘区域募集角膜缘上皮干细胞（LESCs）和角膜微环境细胞（LNCs），通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进组织再生（图1）。

图1 SDF-1/QUDCS/OD水凝胶体系及其治疗绿脓杆菌角膜炎的机制示意图

二、QUDCS/OD水凝胶合成及基本性能检测

QUDCS由脱乙酰度99%的壳聚糖季铵化工艺合成。SEC-MALS分析证实其取代度为0.45、重均分子量维持在1.97×10⁵g/mol，1mg/mL溶液ζ电位为43.5±2.7 mV；醛基负载量为1.03mmol/g（羟胺滴定法验证），¹H NMR证实两者化学改性成功。生理条件下，QUDCS与OD水溶液伯氨基与醛基形成动态亚胺键，无需外界刺激即可快速成胶。流变学测试显示其力学性能具浓度依赖性，时间扫描证实快速成胶且形成稳定黏弹性网络，QUDCS储能模量为4.9~34.1 kPa，与人体角膜基质弹性模量（24~39 kPa）高度匹配；临界应变达820%，远超生理应变。累积释放率显示水凝胶在7天内表现出持续SDF-1释放动力学，在24小时内初始爆发释放35%，然后是稳定的零级释放。体外降解实验显示，42天后，水凝胶质量逐渐损失达到60%，确保了暂时的机械支持，而不会引起长期的异物反应。

图2 QUDCS/OD水凝胶的合成与表征。(A)QUDCS和OD在D2O中的氢核磁共振谱证实化学修饰成功。(B)QUDCS和OD之间的希夫碱交联形成水凝胶的示意图。(C)不同QUDCS浓度下的时间扫描和(D)频率扫描（0.5-3wt%）。(E)应变振幅扫描。(F)交变应变试验（1%/1200%）(G)自愈能力和可注射性的宏观论证。(H)SDF-1的累积释放曲线。(i)2mg/mL溶菌酶的酶降解动力学。(J)SEM显微图显示多孔结构。

三、QUDCS/OD水凝胶的体外抗菌和抗生物膜效果

QUDCS通过膜破坏机制表现出与传统抗生素不同的广谱抗菌活性。该水凝胶对革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌和MRSA）和革兰氏阴性（绿脓杆菌和大肠杆菌）细菌均显示出有效的杀菌活性，其效果与QUDCS浓度直接相关。高分辨率扫描图像显示对照菌细胞表面光滑，形态完整。经QUDCS/OD处理后，细胞表面粗糙、膜起皱和细胞质渗漏。以铜绿假单胞菌为模型生物评估了水凝胶的抗生物膜功效。水凝胶显示出双重抗生物膜活性：防止初始生物膜的形成和破坏已建立的生物膜。结合有效的杀菌活性，对抗生素耐药菌株的有效性，以及优越的生物膜根除，使QUDCS/OD水凝胶有望成为传统抗菌药物的替代品。

图3 QUDCS/OD水凝胶的体外抗菌和抗生物膜效果。(A)不同浓度QUDCS/OD对金黄色葡萄球菌、MRSA、绿脓杆菌和大肠杆菌处理8小时后的细菌菌落。(B)菌落形成单位（CFU）定量测定细菌活力。(C)时间杀伤动力学。(D)细菌形态变化的SEM显微照片。(E)对绿脓杆菌的生物膜形成抑制和(F)成熟生物膜根除效果。(G)扫描电镜和共聚焦激光扫描显微镜图像显示生物膜结构和活力（活/死染色：绿色=活细胞，红色=死细胞）。定量分析(H)生物膜生物量、(I)生物膜蛋白含量、(J)多糖含量。

四、SDF-1/QUDCS/OD水凝胶治疗细菌性角膜炎的疗效观察

SDF-1/QUDCS/OD水凝胶系统的转化潜力通过临床相关的绿脓杆菌角膜炎小鼠模型进行了评估。临床评估显示各治疗组的治疗反应呈双期模式。在最初的48小时内，所有组都表现出相当的疾病严重程度，反映了以细菌增殖和宿主免疫激活为主的急性炎症期。然而，从第3天开始，出现了不同的治疗轨迹。与PBS对照组相比，QUDCS组、SDF-1/QUDCS/OD组、TOB组和TOB + SDF-1组的临床表现渐进式改善（p < 0.05），从第5天开始，装载SDF-1的水凝胶表现出更好的性能。这一时间特征表明，虽然即时抗菌活性提供了最初的疾病控制，但再生因子的持续释放在缓解阶段变得越来越重要。SDF-1/QUDCS/OD对角膜炎所展现的治疗作用远不止其抗菌活性，活跃的组织再生和减少角膜纤维化在本次研究中也进行了进一步的论证。SDF-1/QUDCS/OD的治疗加速受损角膜再上皮化，抑制纤维化因子α-SMA的表达。H&E染色显示SDF-1/QUDCS/OD的治疗保留了正常的角膜结构，对照组表现出广泛的结构破坏，包括上皮增生、间质水肿、多形核细胞浸润和新生血管。小鼠前段光学相干断层扫描（AS-OCT）图像直观地显示了水凝胶在角膜表面的覆盖和保留。单次给药足以满足小鼠角膜炎的整个治疗周期，为感染性角膜炎的抗炎作用、组织修复和疤痕减少提供足够的机械支持和最佳微环境。

图4 SDF-1/QUDCS/OD水凝胶对绿脓杆菌角膜炎小鼠模型的治疗作用。(A)眼前段照片（上排）和荧光素钠染色。(B)定量临床评分。(C)CFU细菌载量定量。(D)（α-SMA，红色）免疫荧光染色。(E)角膜再上皮化完成时间。(F)第7天的组织病理学分析：H&E染色和马森氏三色染色（（h =出血，f =纤维化，u =溃疡，I =炎性细胞浸润，e =水肿）。(G)小鼠前段光学相干断层扫描（AS-OCT）图像显示了水凝胶（箭头）在角膜表面的覆盖和保留。

五、生物相容性评价

生物相容性也是评价生物材料的治疗方法的临床转化的重要指标。本实验中，我们通过体外和体内综合方法系统地评估了SDF-1/QUDCS/OD水凝胶的安全性。其表现出来的细胞相容性，血液相容性及组织相容性均在安全阈值内。通过30天的连续观察来探究水凝胶的远期并发症，小鼠的体重，血常规、生化指标和重要器官均未发现明显改变。

图5 SDF-1/QUDCS/OD水凝胶的体内外生物相容性评价。(A)永生化人角膜上皮细胞（iHCECs）和LESCs + LNCs的活/死荧光成像。(B)细胞活力的定量。(C)溶血试验。(D) TUNEL检测角膜组织切片细胞凋亡，H&E染色（f =纤维化，u =溃疡，I =炎性细胞浸润，e =水肿）。(E) ELISA检测角膜组织匀浆中炎症标志物IL-1 β、IL-1和TNF-α的表达水平。(F)30天后小鼠角膜眼前段照片和荧光素钠染色。(G)30天小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）H&E染色。(H)30天以上体重监测。血液及生化指标。

六、绿脓杆菌性角膜炎中SDF-1/CXCR4轴的时空动态分布

干细胞定向迁移到损伤部位，被称为“归巢”，代表了通过趋化因子受体相互作用介导的组织再生的基本机制。SDF-1/CXCR4轴的生物学功能与其时空分布特征密切相关。这种分布是动态的，而不是静态的或均匀的，同时表现出时间变异性和空间极性。在病理条件下，SDF-1表达调节在内源性和外源性趋化因子传递系统之间表现出不同的动力学。SDF-1/QUDCS/OD水凝胶组显示，从第3天开始，中央角膜的SDF-1水平迅速持续升高，超过了QUDCS对照组和角膜缘区域的水平。这种加速积累反映了外源性SDF-1通过水凝胶成功递送和保留在损伤部位。相比之下，QUDCS组表现出延迟的内源性SDF-1上调，角膜中央水平仅在第9天接近角膜缘表达。这种时间延迟表明，仅靠抗菌治疗不足以诱导最佳组织修复所需的快速趋化因子产生，特别是在绿脓杆菌感染性角膜炎中。表达CXCR4的细胞募集表现出不同的时间动态，尽管SDF-1快速积累，但CXCR4+细胞迁移表现出延迟动力学，这与趋化梯度建立和细胞反应所需的时间一致。SDF-1/QUDCS/OD水凝胶组在第6天显示出大量CXCR4+细胞在角膜中央积聚，超过角膜缘水平，比QUDCS组早约3天。这种加速招募与外源性递送SDF-1的梯度形成相关。这些发现表明建立有效的趋化梯度不仅需要足够的趋化因子浓度，还需要适当的空间分布和时间稳定性。

图6 绿脓杆菌角膜炎进展和治疗过程中SDF-1/CXCR4轴的时空动态。(A)正常对照和未经治疗的角膜炎小鼠角膜缘和中央角膜中SDF-1和CXCR4的免疫荧光定位。DAPI:蓝色。(B)感染后3、6和9天，角膜中SDF-1表达的免疫组织化学（上）和免疫荧光（下）检测。(C)SDF-1平均荧光强度的定量分析。(D)角膜中CXCR4分布。(E)CXCR4平均荧光强度定量。

七、SDF-1介导的角膜缘干细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活

我们进一步研究了这种再生反应的分子机制。免疫荧光证实了角膜缘原代干细胞的表型稳定。持续表达CXCR4，可有效响应SDF-1趋化信号。SDF-1在诱导LESCs和LNCs中显示出强大的趋化性，在500ng/mL时产生最大反应，超过500ng/mL时没有观察到额外的迁移，表明受体饱和。用CXCR4抑制剂AMD3100阻断后，SDF-1诱导的趋化性被消除。Wnt通路抑制剂DKK1显著减弱SDF-1诱导的迁移而不影响基线运动，这为Wnt信号参与SDF-1介导的趋化提供了初步证据。SDF-1对角膜缘干细胞的增殖反应具有时间特异性，仅在治疗72小时后才观察到显著效果，这种先趋化干细胞至损伤部位，后促进增殖的效应是生命体有序调节的体现，避免了干细胞的异常增殖导致肿瘤发生。Western blot分析的分子机制验证显示了经典Wnt通路的激活。SDF-1处理诱导了β-catenin的显著核积累，这是Wnt通路激活的标志。进一步验证GSK3βSer9的磷酸化增强，抑制了GSK3β的催化活性并阻止了β-catenin的降解。SDF-1对角膜缘干细胞的核转运可被DDK1阻断，证实了途径的特异性。

图7 SDF-1介导的LESCs和LNCs中Wnt/β-catenin信号的激活。(A)原代小鼠LESCs表达ΔNp63和ABCG2，LNCs表达Vimentin和SOX2的免疫荧光特性。两种细胞类型都表达CXCR4(B)各处理组transwell图像。(C)迁移细胞数定量。(D)免疫荧光显示向下层迁移的细胞表达ΔNp63、ABCG2（红色）、Vimentin和SOX2。(E)划痕实验。(F)创面愈合率量化。(G)细胞增殖动力学。(H)各处理组72h细胞活力。(I) Western blot分析显示细胞核和细胞质β-catenin分布、p-β-catenin和p-GSK3βser9/总GSK3β表达。(J)不同处理条件下β-catenin（红色）亚细胞定位的免疫荧光成像

八、总结

综上，本研究开发了一种多功能水凝胶体系，将抗菌与组织再生相结合，为细菌性角膜炎提供了新的治疗策略。基础研究层面，证实了SDF-1/CXCR4轴通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导干细胞的趋化和增殖，并详细分析了SDF-1与CXCR4的时空分布模式，为深入理解干细胞调控和推进再生医学提供了新见解。该研究紧扣临床需求，多学科交叉创新，有望缓解我国角膜供体紧缺的现状，为眼病精准治疗与眼用生物材料研发提供新思路。

02

论文第一及通讯作者简介

第一作者

耿雯：华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科，博士后。研究方向为眼表及角膜疾病的基础及临床治疗。

陆艺文：武汉大学化学与分子科学学院2022级博士研究生，研究方向为基于天然高分子的生物医用材料。

通讯作者

张明昌：华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科原主任、二级教授、主任医师，博士生导师。湖北医师协会眼科医师分会主任委员，中华眼科学会委员兼全国角膜病学组委员，中国医师协会眼科分会常委兼干眼及眼表疾病学组副组长，中国医师协会显微眼科专委会副主任委员，海峡两岸医药协会眼科分会副主任委员兼泪液及眼表疾病学组副组长，中华预防医学会公共卫生眼科分会委员，湖北省眼科学会第十届主任委员兼角膜学组组长，武汉巿眼科学会第十四、十五届主任委员，教育部高等院校眼视光指导委员会委员，亚洲干眼协会创始委员，中国医学教育协会眼科分会常委，中国研究型医院协会眼科分会常委，中国老年保健研究会眼科分会常委，中国装备委员会眼科分会常委，中国康复技术及发展促进会眼科专委会常委，全国角膜病学组委员，国家儿童青少年视力健康管理专家咨询委员，国家近视防控专家宣讲团成员，湖北省眼与视力健康学会副主任委员，湖北省视力健康管理协会副主任委员。《Cornea》中文版副主编，中华眼科杂志等十余种杂志编委，中华眼科学会专家会员。国家重点研发计划首席科学家，华中卓越学者。承担国家科技重点专项、国家自然基金、湖北省自然基金重大项目等十余项课题，发表学术论文200余篇。于世界顶级医学杂志《柳叶刀》发文1篇。国际上首先报道PTK联合PRK手术、泪液脂质检测试纸、睑板腺体外器官培养新模型等。获得湖北省科技进步一等奖，中国优秀眼科医师奖、中华眼科创新奖，2018年中国最美眼科医生，2021年中国影响力医生及2022中国眼科年度人物，牵头研发我国首台全飞秒激光近视手术治疗仪，获得两届中国眼科年度十大进展。

蔡杰：武汉大学化学与分子科学学院教授，中南医院兼职教授，博士生导师，国家自然科学基金优秀青年科学基金获得者和国家级人才项目青年项目入选者，中国化学会高级会员。主要研究领域为纤维素、甲壳素/壳聚糖等高结晶天然聚多糖“绿色”新溶剂和新材料。主持和承担国家自然科学基金委员会青年科学基金、面上项目、优秀青年科学基金、重点项目、国际（地区）合作与交流项目，科技部“973”、“863”项目，以及深圳市、湖北省和武汉市科技项目等。在Adv. Mater.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Funct. Mater.等刊物发表SCI论文100余篇。授权国际和中国发明专利30余项。获国家自然科学奖二等奖（第三完成人）等奖励和荣誉。任Elsevier出版社Giant期刊编委、高等学校化学学报和Chemical Research in Chinese Universities第一届青年执行编委。现任中国化学会奖励推荐委员会委员、中国化学会纤维素专业委员会副主任、中国生物材料学会海洋生物材料分会副主任、中国化学会高分子学科委员会委员、中国化学会应用化学学科委员会委员和湖北省天然高分子基生物医用材料工程技术研究中心主任。

谢华桃：华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科党支部书记、副主任，主任医师。擅长角膜与眼表疾病的精准诊疗，聚焦人工角膜及角膜修复新材料的研发与临床应用。兼任中华医学会眼科学分会青年委员、中国医师协会眼感染学组委员、武汉市预防医学会眼健康与疾病防治专委会副主任委员、海峡两岸医药卫生交流协会眼表与泪液学组委员。主持或参与多项国家自然科学基金、国家重点研发计划项目，发表论文40余篇，担任十余种期刊编委/审稿人，获湖北省科技进步一等奖。

03

资助信息

该研究获国家自然科学基金(82171025,82070934,52473101,52173105）、中央高校基本科研业务专项资金（HUST: 2019kfyXMBZ065; WHU: 2042023kfyq05）、湖北省重点研发计划项目（2021BCA146）、武汉市协和医院临床研究基金项目（2021xhlcyj03）、中央地方科技发展指导专项资金（XZ202202YD0021C）资助。

04

原文信息

Geng W, Lu Y, Xu H, Song Y, Liu S, Liu X, Cai J, Zhang M, Xie H. Engineering multifunctional chitosan-based hydrogels for integrated antimicrobial therapy and endogenous stem cell-driven tissue repair in infectious keratitis. Bioactive Materials 2026; 62: 569-86.