免疫细胞圈门策略：去死细胞、去粘连体、圈门顺序，一篇教会你

圈门就是在散点图上一步步划定你感兴趣的区域，从成千上万个细胞中把目标群体「筛」出来。但要注意，圈门策略没有万能模板 —— 它完全取决于你的样本类型和实验目的。

今天，小编带大家看一下国际流式学会（ISAC）旗下的 Cytometry Part A 期刊中的 OMIP 专栏（Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels），里面收录了上百套经过同行评议、可以直接拿来用的多色流式检测方案。其中，OMIP-001 作为开篇之作，教大家学会「如何系统分析人外周血中 T 细胞的分化状态和功能活性」。

今天我们就以 OMIP-001 为主线，再配合一些其他有代表性的图例，一步步拆解免疫细胞圈门的基本思路。

图 1 源自： OMIP-001

第一步：去粘连 —— 确保每个被计数的细胞都独立通过

在获取血液或细胞悬液样本时，细胞与细胞之间常常会发生粘连，形成「双联体」甚至「多联体」。如果这些粘连体被当作单个细胞进行分析，的计数将严重失准，功能分析也会受到极大干扰。

图 2 源自：优宁维官网

当你拿到一份血液或细胞悬液样本时，细胞之间常常会粘在一起，形成「双联体」甚至「多联体」。如果把这些「抱团」的细胞当成单个细胞来分析，细胞数量就会严重失真，后续的功能分析也跟着跑偏。

那么怎么把粘连体去掉呢？OMIP-001 方案在分析的第一关就做了「去粘连」处理。用 FSC-A（前向散射光脉冲面积）和 FSC-W 或 FSC-H（前向散射光脉冲宽度或高度）这两个参数来比对。

原理其实不复杂：单个细胞通过激光束时，信号的面积和高度大致成正比；而两个细胞粘在一起通过时，面积会明显变大，但高度变化不大 —— 两者的比例就会出现异常。你只需要在散点图上圈出「面积 ≈ 高度」那个线性区域里的细胞，就能有效排除双联体。此外：不同型号的流式细胞仪可能用不同的参数组合（比如 FSC-W/FSC-A 或 FSC-H/FSC-A）。如果你做细胞周期实验，用 A 和 W 的组合去粘连会更彻底。

图 3 源自：优宁维官网

第二步：排除死细胞

活细胞与死细胞之间一个关键的区别在于细胞膜的完整性。活细胞细胞膜完整，荧光染料无法自由进入，染色信号清晰可控；而死细胞的细胞膜发生破损，各种抗体和染料会非特异性结合到胞内组分上，产生大量虚假的阳性信号。

图 4 源自：小桔网

OMIP-001 方案中采用了胺反应型死活染料 VIVID 来识别死细胞。活细胞的细胞膜完好，染料不能进入，信号维持低水平；死细胞膜破损，染料自由渗入并与胞内蛋白质发生共价结合，荧光信号陡升。研究者将 VIVID 的荧光信号绘制成直方图，圈出低荧光区域（即活细胞区域），这样就从源头上将有问题的死细胞排除在外。

OMIP-001 在排除死细胞的同时，将 CD14 和 CD19 纳入同一个「排除通道」——CD14 标记单核细胞和巨噬细胞，CD19 标记 B 细胞 —— 这样在第一步去粘连之后，通过一次操作就完成了「活细胞+去除单核/B 细胞 」的双重筛选，高效且简洁。

图 5 源自：OMIP-001

第三步：从淋巴细胞门到 T 细胞

在活细胞群体中，不同类型的细胞在大小（FSC）和内部颗粒复杂度（SSC）方面差异显著。根据 FSC 和 SSC 两个物理参数，可以初步区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。FSC 越高代表细胞越大，SSC 越高代表胞内颗粒结构（如溶酶体、分泌囊泡等）越丰富。（标本在 FSC/SSC 散点图可将淋巴细胞群（R1，红色）、单核细胞群（R2，绿色）、粒细胞群（R3，紫色）、非白细胞群（R4，蓝色）清晰地区分开。

图 6 源自：流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

根据淋巴细胞的发生来源、形态结构、表面标志物及免疫功能不同，淋巴细胞可分为 T 细胞(CD3+)、B 细胞 (CD3-CD19+) 和 NK 细胞 (CD3-CD16+CD56+) 等细胞群，此外，根据 CD4 和 CD8 的表达不同，T 细胞又分为 2 个亚群：辅助性 T 细胞 (CD3+CD4+) 和杀伤性 T 细胞 (CD3+CD8+)。

图 7 源自：知乎网

如果你在同一个实验中希望同时分析淋巴细胞中所有的免疫细胞亚群，可以从淋巴细胞门先分 CD3+T 细胞。而也有先圈出 CD45+的总白细胞，再逐步分选 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、单核细胞、树突状细胞等各类免疫细胞亚群，从而构建一个完整的全白细胞图谱。总之不同方案服务于不同的研究目标，圈门逻辑也随之调整。

图 8 源自：https://www.iivd.net/thread-79634-1-1.html

第四步：功能评估与记忆/分化亚群分析

OMIP-001 之所以被称为 OMIP 系列的「开篇经典」，是因为它不只停留在 T 细胞的「身份鉴定」，在确定了 CD4+和 CD8+T 细胞后，还进一步回答了「这些 T 细胞到底能干什么」这个深层问题 ——也就是「功能性免疫学」的核心命题。

图 9 源自：优宁维官网

（1）功能评估：在确定了 CD4+和 CD8+T 细胞后，进一步检测三种关键细胞因子的分泌情况：如 IFN-γ（干扰素-γ，反映 T 细胞的杀伤性潜能）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α，反映炎症效应能力）和 IL-X（白介素-X，反映 T 细胞的增殖和分化）。

图 10 源自：小桔网

OMIP-001 的策略是：利用 FlowJo 软件中的 Boolean gate（布尔逻辑门）功能，将所有分泌任意一种细胞因子的 T 细胞定义为「功能性阳性群体」（cyt+），获得一个针对「T 细胞真实功能」的总体画像。这种「表型+功能」的双层分析逻辑 ——先整体评估 CD4+和 CD8+ T 细胞的因子分泌能力，再综合评估各个亚群的功能状态。

图 11 源自：OMIP-001

（2）记忆与分化：将功能性阳性细胞映射回表面标志物的表达组合后，下一步需要确认：这些能分泌细胞因子的 T 细胞，到底处于分化路途上的哪个阶段？

OMIP-001 采用 CD45RO 和 CCR7 的组合，将 CD4+和 CD8+ T 细胞进一步区分为：初始 T 细胞（CD45RO-CCR7+）、中央记忆 T 细胞（CD45RO+CCR7+）、效应记忆 T 细胞（CD45RO+CCR7-）以及终末分化效应记忆 T 细胞（TEMRA，CD45RO-CCR7-）。同时，方案中还整合了 CD27、CD57、PD-1 等标志物，用以辨别记忆细胞是否保留共刺激/增殖潜能（CD27+），是否存在衰老/耗竭状态（CD57+PD-1^low / PD-1^high），以及是否仍保有长期存活与再激活能力（CD127/CD28）。

CD45RA/CCR7 四象限分型已经成为 T 细胞分化免疫学评价领域的基本工具。

图 12 源自：OMIP-001

最后提供一个实例应用：小鼠全血白细胞分化全套设门方案

如果你不满足于仅仅分析 T 细胞，而是希望全面分析小鼠血液中的全部白细胞亚群，那么 2024 年发表在 Cells 期刊上的一篇研究可以为你提供一个完整的技术模板。该研究由德国的 Elise Arlt 等人主导，在 C57BL/6J 小鼠中建立了一套从样本处理、抗体染色到全套圈门策略的标准化方法。（文章提供了免疫细胞中多种亚群的圈门策略，具体可以参考文献中的图例）

其圈门流程分为以下关键步骤：

第一步：排除碎片：利用 FSC 和 SSC 散点图，将红细胞、血小板和细胞碎片排除在外（这类组分通常聚集在左下角）；

第二步：排除死细胞：采用碘化丙啶（PI）标记并排除死细胞；

第三步：圈出白细胞：利用 CD45 这一白细胞泛标志物，筛选出 CD45+的完整白细胞群体；

第四步：各亚群分型：在上述 CD45+白细胞的基础上，利用各种特异标志物进一步圈出 T 细胞（CD3+）、B 细胞（CD19+）、NK 细胞（NK1.1+）、单核细胞、粒细胞、树突状细胞及肥大细胞等多种细胞亚群，并成功完成了老龄/幼龄以及雄/雌小鼠的白细胞分化计数比较。

图 14 PMID: 39329764

此外，该研究在去死细胞和去粘连之前，还额外增加了「去双联体」步骤—— 先用 FSC-A/FSC-H 两个参数排除双联体和多联体，再用 SSC-W/SSC-H 进一步排除黏连事件，从而最大限度地确保了数据准确性。

需要注意的是，圈门策略并没有一个「万能模板」。采用哪种策略，完全取决于你的实验设计、样本性质以及你打算回答何种科学问题。

圈门遇到拿不准的？可以进群和学霸菌一起讨论，识别下方图片，回复「流式」，进来一起「云实验」！

编辑：冷漠小 z

题图：自制