浙江大学Angew：主动学习加速抗真菌聚合物发现

侵袭性真菌病（IFD）是由致病真菌侵入深部组织、内脏或血流引起的危及生命的全身性感染，死亡率极高，已成为全球公共卫生领域的严重威胁。其中，白色念珠菌（ Candida albicans）是最常见的致病真菌之一。然而，目前临床上可供选择的抗真菌药物种类有限，且传统药物面临疗效不足、毒性较大以及耐药性日益严重等问题。受天然抗真菌肽（AFP）结构启发而设计的仿生聚合物被视为极具潜力的候选方案，但聚合物的结构多样性极为庞大，如何在浩瀚的化学空间中快速筛选出兼具强效抗真菌活性和优良生物相容性的候选分子，一直是该领域的重大挑战。

针对这一难题，浙江大学金桥教授、王幽香副教授团队开发了一种名为PolyCAML的主动学习驱动型智能框架，用于加速抗真菌聚合物的发现。该平台整合了仿生分子设计、组合化学、自动化高通量合成与表征，以及图变换器（Graph Transformer）机器学习模型，通过“设计–构建–测试–学习”（DBTL）的闭环迭代工作流程，在短短18天内从超过51万种组合的虚拟库中高效筛选出高性能候选聚合物。相关论文以“Active Learning-Accelerated Discovery of Antifungal Polymers With Self-Assembly Capacity for Tackling Invasive Fungal Diseases”为题，发表在Angewandte Chemie International Edition上。

研究团队首先基于抗真菌肽的结构特征和作用机制，构建了一个包含516,114种四元共聚物组合的大规模虚拟库（图1B）。为实现精准的活性预测，团队建立了基于图变换器的多任务机器学习模型（图1C）。在该图表示中，每个共聚物组分被建模为独立的子图，并通过虚拟节点编码各组分的进料比例。经自监督预训练和下游任务微调后，该模型在预测抗真菌活性和生物相容性方面表现出优于随机初始化图神经网络、随机森林（RF）和极端梯度提升（XGB）等模型的性能，各项归一化统计指标均表现最优（图2D），尤其在处理初始数据中稀少的高性能“异常值”时，展现出了卓越的泛化能力。

图1：（A）抗真菌肽（AFP）与AFP仿生聚合物的典型化学结构对比。（B）基于AFP仿生策略构建的四元共聚物虚拟库。（C）PolyCAML主动学习加速发现平台的DBTL迭代工作流程。

基于这一模型，研究团队结合贪婪算法启动了主动学习迭代。在初始种子数据集中，大多数聚合物虽然溶血毒性较低，但抗真菌活性十分稀缺（图2B、图2C）。随着四轮DBTL迭代的推进，筛选候选物的整体抗真菌效力显著提升，而溶血毒性虽有波动但最终回归至理想范围，双目标优化成功收敛（图2E）。通过这一流程，团队最终确定了11种经过实验验证的候选聚合物（P1–P11），其最小抑菌浓度（MIC）均不超过4 μg/mL，且半数溶血浓度（HC₂₀）均不低于2048 μg/mL。

图2：模型训练框架与迭代优化过程。（A）共聚物图表示学习的数据预处理和模型训练工作流程。（B）种子数据集中共聚物抗真菌活性和溶血活性的热图。（C）种子数据集中共聚物抗真菌和溶血性能的分布。（D）预训练图神经网络（本研究模型）、随机初始化图神经网络、随机森林和XGB在种子数据集上的定量性能对比，各项指标已归一化处理。（E）各轮迭代中筛选候选物的抗真菌和溶血性能分布。

为了深入理解结构–性能关系，团队对筛选出的高性能聚合物进行了系统分析。筛选获得的候选聚合物中，部分单体类型出现频率显著较高（图3A、图3B），且模型在12个关键分子描述符上的预测值与实验值吻合良好（图3C）。在此基础上，团队进一步通过SHAP（Shapley Additive Explanations）分析探究各描述符的贡献度，研究发现拓扑极性表面积（tPSA）、摩尔溶解度（log S）、阳离子单体的间隔基碳数以及疏水单体的计算分配系数（clog P）是影响抗真菌效力和生物相容性的主要因素（图3D、图3E）。具体而言，tPSA过高会增强分子极性和水合能力，形成致密的水化层，阻碍聚合物吸附到真菌膜上，同时加剧与红细胞的非特异性极性相互作用，导致溶血风险上升；而较高的log S则因提高水溶性、防止分子聚集而有利于抗真菌活性；clog P越高，疏水性越强，虽有助于膜插入但也更容易破坏红细胞膜完整性；阳离子单体间隔基长度则通过调控分子构象灵活性和两亲性平衡，产生复杂的双重调控效应。这些发现为未来抗真菌聚合物的理性设计提供了重要指导。

图3：结构演化分析与关键描述符解读。（A）HC₂₀/MIC > 1的筛选候选物中单体类型和比例分布热图。（B）筛选获得的前5种高频单体代表性结构。（C）log₂MIC和log₂HC₂₀的实验值与预测值对比。（D）基于SHAP绝对值排序的关键分子描述符（对抗真菌性能和生物相容性的影响）。（E）关键描述符对生物活性的正负SHAP效应可视化。

在体外活性评估中，研究团队进一步测定了11种候选聚合物的最低杀菌浓度（MFC）和对小鼠成纤维细胞（L929）的半数抑制浓度（IC₅₀）（图4A、图4B）。结果显示，P4、P5、P6和P7四种聚合物表现出最低的MFC（8 μg/mL）和最高的IC₅₀（≥512 μg/mL），因而具有最高的选择性指数（SI = IC₅₀/MFC），兼具优异的杀菌效力和生物相容性（图4C）。这四种目标聚合物的化学结构如图4D所示。机制研究表明，这些聚合物能够破坏真菌外膜通透性（图4E）、引起细胞质膜去极化（图4F），并导致胞内K⁺大量泄漏——处理组的K⁺浓度约为未处理组的100倍（图4G）。扫描电镜和透射电镜图像清晰显示，经处理后真菌细胞出现明显的膜皱缩、表面裂缝、胞质膜完整性破坏及胞内物质泄漏（图4H、图4I）。活/死染色实验进一步证实了其强效杀菌能力（图4J）。更为重要的是，时间杀菌曲线显示，在4倍MFC浓度下，目标聚合物在1小时内即可杀灭超过99.9%的白色念珠菌，而传统药物氟康唑（FCZ）在同样时间内仅能杀死约10%的真菌，且需要约3.5小时才能达到相同杀菌水平（图4K）。此外，经过100代连续传代培养，目标聚合物几乎未诱导真菌产生耐药性，而氟康唑组的耐药性则显著上升（图4L）。

图4：目标聚合物对浮游白色念珠菌的体外抗真菌活性及作用机制。（A）PolyCAML筛选的11种高性能候选物的MFC。（B）11种高性能候选物对L929细胞的IC₅₀。（C）11种高性能候选物的选择性指数（IC₅₀/MFC）。（D）筛选获得的目标AFP仿生聚合物（P4、P5、P6、P7）的化学结构。（E）目标聚合物的外膜通透性能力。（F）目标聚合物诱导的细胞质膜去极化。（G）目标聚合物在4倍MFC下处理6 h后白色念珠菌的K⁺泄漏。（H）不同处理后白色念珠菌细胞的SEM图像。（I）不同处理后白色念珠菌细胞的TEM图像。（J）目标聚合物在4倍MFC下处理6 h后白色念珠菌的活/死染色。（K）目标聚合物和FCZ对白色念珠菌的杀菌动力学。（L）目标聚合物和FCZ对白色念珠菌的耐药性发展。

利用目标聚合物本身的两亲性结构，P4–P7在水溶液中可自发组装成带正电荷的纳米颗粒（NPs），平均水合粒径约为100 nm（图5A），Zeta电位结果显示其表面带正电荷（图5B）。正电荷表面有利于增强对致密生物膜的穿透能力。随后，团队将氟康唑装载至纳米颗粒中（FCZ@NPs），载药量约为10%（图5C）。为验证纳米颗粒的穿透能力，研究团队制备了尼罗红包裹的纳米颗粒（NR@NPs），并与成熟的白色念珠菌生物膜共孵育。共聚焦激光扫描显微镜图像显示，游离尼罗红处理组仅检测到极微弱的红色荧光，而NR@NPs则能有效穿透生物膜，红色荧光从膜表面分布至深层内部（图5D、图5F）。结晶紫染色（图5E）定量分析表明，游离氟康唑对生物膜生物量的减少不足7%，而空白纳米颗粒本身即可减少约80%的生物膜生物量。令人惊喜的是，FCZ@NPs在同等浓度下实现了高达93%的生物膜生物量减少（图5G），展现了强大的成熟生物膜结构破坏能力。SYTO-9活菌染色（图5I）及其半定量分析（图5H）进一步证实了FCZ@NPs的卓越抗生物膜效果，表明该策略通过增强药物渗透实现了协同抗生物膜作用。

图5：由目标聚合物自组装形成的载FCZ纳米颗粒的体外抗生物膜评价。（A）目标聚合物组装纳米颗粒的DLS和TEM图像。（B）目标聚合物组装纳米颗粒的Zeta电位。（C）FCZ@NPs中FCZ的载药量。（D）NR@NPs或游离尼罗红与白色念珠菌生物膜孵育2 h后的CLSM图像。（E）FCZ@NPs、空白NPs和游离FCZ处理后白色念珠菌生物膜的结晶紫染色图像。（F）CLSM图像中红色荧光强度的半定量分析。（G）FCZ@NPs、空白NPs和游离FCZ处理后白色念珠菌生物膜生物量减少的定量分析。（H）FCZ@NPs、空白NPs和游离FCZ处理后残留白色念珠菌的半定量分析。（I）FCZ@NPs、空白NPs和游离FCZ处理6 h后生物膜中活白色念珠菌的CLSM图像。

在体内系统性真菌感染（真菌血症）模型中（图6A），研究人员通过尾静脉注射白色念珠菌建立了感染小鼠模型，并在感染后0.5、12和24小时分别静脉给予P4–P7聚合物（50 mg/kg）。治疗后第3天，心、肝、脾、肺、肾五大主要器官的真菌载量检测显示，目标聚合物组较生理盐水组的真菌负荷降低了2.4至3.7个数量级，疗效达到甚至超过了氟康唑组（图6B）。同时，感染常伴随的全身炎症反应——表现为白细胞（WBC）和中性粒细胞（Neu）显著升高——在目标聚合物治疗后均恢复至接近未感染对照组的正常水平（图6C、图6D）。第7天的H&E染色显示，生理盐水组心、肝、脾、肺、肾组织存在明显的炎症细胞浸润，而目标聚合物治疗组各器官组织结构完整，未见明显病理损伤（图6E）。更为重要的是，在为期7天的生存率监测中，生理盐水组小鼠生存率不足20%，氟康唑组为83%，而P4、P5、P6和P7治疗组的所有小鼠均存活（图6F），且体重恢复至约30 g，与健康对照组相当（图6G），充分证实了其在治疗侵袭性真菌感染方面的卓越疗效。

图6：目标聚合物在白色念珠菌诱导的小鼠真菌血症模型中的体内治疗效果。（A）白色念珠菌诱导真菌血症的治疗流程示意图。（B）不同处理后第3天心、肝、脾、肺、肾中白色念珠菌的菌落计数。（C）不同处理后第3天血液中的WBC水平。（D）不同处理后第3天血液中的Neu水平。（E）不同处理后第7天心、肝、脾、肺、肾组织的H&E染色。（F）不同处理后7天内的生存率曲线。（G）不同处理后7天内的体重变化。

在真菌性角膜炎模型（一种典型的生物膜相关感染模型）中，研究团队进一步评估了FCZ@NPs的体内抗生物膜疗效（图7A）。通过向角膜注射白色念珠菌建立感染模型后，连续三天局部给予FCZ@NPs（0.5 mg/kg）。裂隙灯成像（图7B）和临床评分（图7C）显示，感染后第1天所有小鼠均出现典型感染特征（角膜水肿和严重混浊），但FCZ@NPs治疗组在第11天时临床评分显著降低，远低于生理盐水组和游离FCZ组，角膜混浊、水肿和炎症浸润明显减轻。第4天角膜真菌载量检测显示，FCZ@NPs使真菌定植量较生理盐水组减少了约3个数量级（图7D）。荧光素钠染色表明，FCZ@NPs治疗组角膜上皮修复加速，损伤显著减轻（图7E）。光学相干断层扫描显示，生理盐水组中央角膜厚度增至约155 μm（正常约77 μm），而FCZ@NPs治疗组中央角膜厚度恢复至正常范围（图7F、图7G），角膜结构完整透明（图7H）。组织病理学分析（H&E染色和PAS染色）进一步证实，FCZ@NPs治疗组角膜上皮连续完整，基质结构致密规则，基底膜完好，组织学形态接近正常状态，而对照组则呈现显著病理损伤（图7I、图7J）。

图7：FCZ@NPs在白色念珠菌诱导的小鼠角膜炎模型中的体内治疗效果。（A）真菌性角膜炎治疗流程示意图。（B）不同处理后眼睛的裂隙灯照片。（C）11天内不同处理后的眼部临床评分。（D）不同处理后第4天角膜组织的菌落计数。（E）不同处理后第11天角膜的FLS染色。（F）不同处理后第11天角膜的OCT成像。（G）OCT图像中角膜厚度的统计数据。（H）不同处理后离体感染角膜的数字照片。（I）不同处理后角膜的H&E染色。（J）不同处理后角膜的PAS染色。

综上所述，该研究成功建立了一个名为PolyCAML的通用型智能预测平台，通过主动学习驱动的DBTL闭环迭代，在极短时间内从超50万种组合的化学空间中高效筛选出兼具强效抗真菌活性和优良生物相容性的目标聚合物。这些聚合物不仅能自发组装为纳米载体增强传统抗真菌药物对生物膜的渗透和协同杀伤效果，还在两种动物感染模型中展现了优异的体内治疗效果。该平台模块化架构允许灵活替换单体构建单元、预测任务和实验表征流程，可便捷地拓展至抗氧化、组织粘附等其他功能聚合物的高通量发现。这项研究不仅为侵袭性真菌病的治疗提供了有前景的新型候选药物，更为功能高分子材料的智能加速研发开辟了通用化道路。