《食品科学》：广东海洋大学曹文红教授等：降胆固醇牡蛎肽的构效关系解析：肽组学与生物信息学整合研究

广东海洋大学食品科技学院的张烘煜、王禹鸥、曹文红*等人采用肽组学与生物信息学技术探究牡蛎肽（OPs）降胆固醇的构效关系。通过离子交换色谱分离获得3 个组分（OP-1、OP-2、OP-3），其中OP-2表现出最强的胰脂肪酶抑制率（76.16%）与胆固醇酯酶抑制率（66.43%），并能浓度依赖性地降低总胆固醇水平。液相色谱-质谱联用技术分析表明活性肽段（＜3 kDa）富含疏水性（Leu、Ala）与酸性氨基酸残基（Asp、Glu）。经生物信息学与分子对接鉴定，关键活性肽LPFQ与LNFP具有双酶抑制活性。在HepG2细胞模型（5.0×105 细胞/孔接种于6 孔板）中，LNFP通过减少细胞内胆固醇积累和增强低密度脂蛋白摄取，表现出显著的降胆固醇作用。在50 μmol/L浓度下，其降胆固醇效果与10 μmol/L辛伐他汀对照组相似。这些发现突出了对双重酶抑制和肝脏胆固醇调节至关重要的结构基序，强调了OP作为天然降胆固醇剂和未来治疗开发有前景的候选物的潜力。后续有必要进一步研究其胃肠道稳定性和体内疗效，以全面评估其在饮食干预中的潜力。

1 牡蛎肽（OPs）的离子交换分离及体外活性测定

1.1 牡蛎肽的离子交换色谱分级

肽由于其侧链和末端残基中含有的氨基和羧基而具有固有的电荷。这一特性使离子交换色谱（IEC）能够根据肽表面电荷的差异对其进行分离，而表面电荷决定了它们与固定相的相互作用方式。

在我们的研究中，我们使用了CaptoTM Q——一种带有固定正电荷的强阴离子交换树脂——从牡蛎蛋白水解物中选择性捕获阴离子肽。如图2a所示，该过程产生了三个不同的肽组分：OP-1、OP-2和OP-3。OP-1未与树脂结合，直接洗脱。相反，阴离子肽OP-2和OP-3在引入含NaCl的洗脱液之前保持结合状态——这与阴离子交换柱的预期行为一致。这些结果表明，在碱性条件下，OP-1可能带有净正电荷，而OP-2和OP-3带负电荷，这表明其中酸性残基（如天冬氨酸和谷氨酸）的比例较高。这种组成通常会导致较低的等电点（pI < 7）。有趣的是，先前的研究报告称，酸性肽（即低pI值的肽）通常表现出更强的降胆固醇活性。与此一致，我们的数据支持阴离子牡蛎肽可能比阳离子牡蛎肽具有更大的降胆固醇潜力的观点。

1.2 体外评估OPs的降胆固醇活性

CE，也称为胆固醇酯酶，是一种关键水解酶，可将胆固醇酯分解为游离胆固醇和脂肪酸。它在胆固醇代谢、胶束形成和心血管健康中起核心作用，并存在于肝脏、血浆和肠道中。胰脂肪酶（PL）则分泌至肠道，对膳食甘油三酯的消化至关重要，可将其转化为甘油和游离脂肪酸。其活性直接影响脂肪被吸收和用作能量的效率。由于胆固醇酯和磷脂都参与高胆固醇血症和肥胖等代谢状况，抑制它们的活性已成为限制饮食胆固醇摄入和管理脂质相关疾病的一种公认方法。在本研究中，我们在5至30 mg/mL的浓度范围内测试了OPs，发现它们以剂量依赖性方式抑制胆固醇酯和磷脂（图2b和2c）。在各组分中，OP-2表现最为有效，对PL的抑制率为76.16%，对CE的抑制率为66.43%。OP-1和OP-3显示出中等活性，而粗OPs混合物的效果最弱。这些结果表明，OPs可能会干扰酶的功能——可能是通过与活性位点结合或改变酶的形状——从而破坏脂质的分解和吸收。

2 LC-MS分析

采用120分钟梯度进行LC-MS分析。在所有三个组分中共鉴定出6842条肽序列。肽的鉴定得到了大量肽谱匹配（PSMs）的支持，其中OP-1为18542个，OP-2为15328个，OP-3为7215个。如表1所示，三个组分（OP-1、OP-2和OP-3）的PSMs分别包含3103、2555和1184条已鉴定肽序列。各组分间观察到显著的肽重叠。OP-2和OP-3共享的肽数量最多（611条序列），而246条肽序列为三个组分共有。主要肽丰度的变异系数（CV）小于15%，表明鉴定结果在技术重复中具有可重复性。

3 氨基酸组成和分子量分析

图3a显示了我们通过离子交换色谱（IEC）获得的三个组分的氨基酸组成。与原始粗肽提取物相比，纯化组分中明显含有更多的非极性残基——如脯氨酸（P）、缬氨酸（V）和亮氨酸（L），而天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）等极性残基则减少。这种模式表明，OP-1富含阳离子肽，而OP-2和OP-3主要由阴离子肽组成，这与我们在图2a中早先观察到的IEC洗脱行为相符。

如图3b进一步所示，与粗提取物相比，所有三个组分中的疏水性氨基酸含量均显著增加。这与图3a中观察到的组成变化一致。值得注意的是，先前的研究已将疏水性残基与降胆固醇活性的提高联系起来，部分原因是它们可以干扰胆汁酸胶束的形成并有助于限制胆固醇的吸收。

从图3c中的分子量和肽链长度来看，大多数鉴定出的肽含有3至20个氨基酸。这与已知有助于降低胆固醇的低分子量肽的典型报道结果一致。例如，在一项使用海参生殖腺水解物（分子量低于3 kDa）的研究中，该分子量范围内的肽中近98.8%有助于改善脂质代谢。在我们的研究中，三种OP组分均仅含分子量小于3 kDa的肽，这与已知的降胆固醇肽特征相符。

疏水性氨基酸倾向于与胆固醇、胆汁酸和其他甾醇发生强烈相互作用。事实上，富含脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸等残基的肽已被证明能有效抑制胆固醇胶束的形成，从而减少胆固醇的吸收。另一个关键靶点是HMGCR——胆固醇合成中的限速酶。疏水性肽似乎通过与其中催化位点结合的方式（类似于他汀类药物）阻断其活性。一个很好的例子是亚麻籽肽IGFLIIWV（也称为H3），它以剂量依赖性方式抑制HMGCR（IC50≈59 μmol/L），并通过SREBP-2通路上调LDLR来帮助调节HepG2细胞中的胆固醇代谢。这凸显了疏水性残基如何介导肽-酶相互作用，并支持它们作为天然降胆固醇候选物的潜力。

低分子量肽往往表现出更强的降胆固醇效果，部分原因是它们在肠道中更易被吸收，且更能抵抗消化酶的降解。以胆固醇转运蛋白NPC1L1为例，它有助于肠黏膜吸收胆固醇。但当暴露于分子量低于3 kDa的绿豆蛋白水解物时，Caco-2细胞模型显示NPC1L1表达降低。这种变化可降低膳食胆固醇的吸收并增加其排泄。此外，来自小麦胚白蛋白等来源的小肽（通常富含疏水性残基）可形成球形微结构。这些结构可能帮助肽与脂质靶标更强烈地相互作用，或通过疏水性结合促进其向器官的运输。此外，当更多肽分子被包装到相同体积中时，它们更有可能与胆固醇胶束碰撞并破坏其结构。

最后，如图3d所示，相关性热图揭示了氨基酸组成与胆固醇酯酶抑制（CEI）之间的残基特异性关联。苯丙氨酸（Phe）与CEI无正相关，反而呈现出负相关趋势。因此，疏水性残基对CE抑制的贡献不应简单地概括为所有疏水性氨基酸。这些结果表明，除了肽的整体疏水性外，特定残基类型、残基位置和序列背景可能共同影响牡蛎肽的CE抑制潜力。

4 肽组学分析

4.1 降胆固醇肽的理化性质

在质谱分析中，我们将肽离子得分高于60的视为可靠结果，因此仅将超过此阈值的肽纳入蛋白质组学分析。为了解三种肽组分的理化性质，我们使用了PepDraw和GRAVY计算器工具，结果总结于图4。

GRAVY指数有助于估计肽是亲水还是疏水——正值表示疏水性，负值则表示亲水性。如图4a1–c1所示，三种组分中的大多数肽均显示出正GRAVY值，表明整体上富含疏水特性。

至于等电点（pI），图4a2–c2显示，OP-1、OP-2和OP-3中的大多数降胆固醇肽的pI值低于7，在溶液中属于酸性。先前的研究已表明，较低的pI与更强的降胆固醇潜力相关。

就净电荷而言，OP-2和OP-3中的肽大多低于零（图4a3–c3），这可归因于带负电的酸性氨基酸的存在——这一特征与良好的降胆固醇活性相关。有趣的是，OP-1也表现出较强的活性，这可能是因为其大多数肽的净电荷为0或+1，很大程度上归因于精氨酸残基。已知富含精氨酸的肽在某些情况下能有效抑制PL。

4.2 肽段N端和C端氨基酸分析

三种肽段的末端氨基酸模式如图5所示。在所有肽段中，亮氨酸（L）均频繁出现在N端和C端。OP-2呈现出独特的“L-D-D-D-F”基序——高度酸性、疏水性和芳香族——其中亮氨酸常位于第一位，随后是一段天冬氨酸（D）和苯丙氨酸（F）。OP-3显示出类似的但保守性较低的“L-D-F-D-D”模式，表明其具有静电和疏水相互作用潜力的结合。相比之下，OP-1主要由脯氨酸（P）和亮氨酸（L）组成，使其整体呈疏水性，但缺乏强带电残基。

研究表明，肽段末端（尤其是N端）存在亮氨酸可增强其与PL上疏水区域的结合，从而提高抑制效果。亮氨酸还通过mTOR信号通路抑制脂肪生成、刺激脂肪分解和脂肪酸氧化，并促进脂肪细胞中瘦素的分泌，最终减少脂肪堆积。

值得注意的是，亮氨酸可代谢为α-酮异戊酸（KIC），进而转化为β-羟基-β-甲基丁酸（HMB）。运动员相关研究表明，补充HMB可降低心血管风险标志物，如低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇和甘油三酯。通过调节脂酶和脂肪酸合酶等酶类，亮氨酸及其他支链氨基酸有助于在肝脏和肠道中调控脂质代谢通路，从而影响血清胆固醇水平。

天冬氨酸（D）在生理条件下带有带负电荷的羧基，可通过静电相互作用与阳离子胆汁盐结合。这增强了胆汁酸的结合能力，破坏胶束形成，最终减少肠道对胆固醇的吸收。其极性和酸性使其成为通过胆汁酸途径干扰胆固醇吸收的理想选择。

苯丙氨酸（F）兼具疏水性和芳香性，可整合到胆汁盐-胆固醇胶束中，降低其溶解度并限制胆固醇吸收。一项研究中，源自豇豆的以苯丙氨酸结尾的二肽（如异亮氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸）模拟了他汀类药物底物，通过竞争性抑制HMGCR，在体外将酶活性降低了77%–78%。

最后，脯氨酸（P）通过其环状侧链贡献结构稳定性，帮助肽在生理条件下维持活性构象。脯氨酸存在于肽末端时，与改善稳定性、生物相容性和降胆固醇效果相关。例如，Kubyshkin等人发现，增加脯氨酸含量可增强与低密度脂蛋白受体（LDLRs）的结合，促进胆固醇清除。

5 降胆固醇肽的鉴定、筛选与表征

对小于3 kDa的组分进行肽序列分析，结合液相色谱-质谱联用（LC-MS）和数据库检索，在三个组分（OP-1、OP-2和OP-3）中共鉴定出6842条肽。为从这一大量数据中系统性地识别有前景的候选肽，实施了多步骤生物信息学筛选流程。具体步骤如图6所示。

初步筛选步骤旨在富集具有较高普遍生物活性可能性的肽段。为此，所有鉴定出的肽段均通过PeptideRanker网络服务器（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）进行分析。总共有1205条肽段的PeptideRanker评分大于0.8，被选中进行进一步分析。随后，基于氨基酸组成进行了二次筛选。由于丙氨酸（A）、异亮氨酸（I）、色氨酸（W）、甲硫氨酸（M）、苯丙氨酸（F）、脯氨酸（P）和缬氨酸（V）等疏水性氨基酸与胆汁酸、甾醇、胆固醇及其他脂质之间存在强疏水相互作用，是脂质代谢活性的关键贡献者，因此被认为是降胆固醇肽的特征性残基。因此，设定这些特征性氨基酸的总含量阈值为>49%。应用此过滤条件后，得到488个候选肽段。

为控制多重比较产生的FDR，将PepSite2得到的原始P值进行Benjamini-Hochberg校正。经过这种严格的统计调整后，有89个肽段（校正前为215个）对至少一种靶酶显示出具有统计学意义的结合预测（校正后P值（q值）< 0.05），这些肽段现已标注q值。从这89个统计学可靠的肽段中，最终选取了30个肽段（每个组分OP-1、OP-2和OP-3各10个）用于分子对接模拟。每个组分内的选择基于其校正后的PepSite2结合预测（q值）的显著性排名，同时考虑潜在合成的实用肽段长度（3–15个氨基酸）。所选肽段含有3–9个氨基酸残基，分子量范围为365 Da至979 Da。为为其鉴定提供直接证据，表2中展示了五个关键肽段（LPFQ、LNFP、FSL、YPPIATPF、PFRP）的注释MS碎片光谱。这些特征与先前报道的降胆固醇肽一致，后者通常由2–15个氨基酸残基组成，分子量< 3 kDa。

为了更深入地了解结构-活性关系，我们将最终确定的高活性肽（例如LPFQ和LNFP）的特征与更广泛的已鉴定序列进行了比较。活性肽具有共同特征：低分子量（< 1 kDa）、高疏水氨基酸含量（> 49%）、酸性等电点（< 7），以及与PL（例如His264）和CE（例如Ser194/His435）的催化残基形成有效相互作用的能力。相比之下，未被优先选择或预测为无活性的肽通常表现出相反的特征：1）相对较高的分子量；2）较低比例的疏水残基；3）中性或碱性等电点≥ 7。此外，对几种代表性无活性肽的初步分子对接分析（数据未显示）表明，其结合能较差，且无法与关键催化残基相互作用。这种比较分析进一步支持了我们的观点，即低分子量、高疏水性和酸性是有机磷化合物双酶抑制活性的关键结构决定因素。

6 分子对接

在使用PeptideRanker和PepSite2进行初步生物信息学筛选后，分子对接被用作下一步更严格的筛选步骤，以进一步缩小候选肽库。主要目标是识别不仅具有有利结合能，而且很可能参与PL和CE催化机制的肽。具体而言，30种降胆固醇肽被对接到两种酶的活性位点，以确定它们的最佳结合构象。从三个组分中共鉴定出五种新型肽：OP-1中的两种（YPPIATPF和FSL），OP-2中的两种（LPFQ和LNFP），以及OP-3中的一种（PFRP）。通过BIOPEP-UWM数据库（https://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep）进行全面检索，确认这五种肽此前未被报道。

6.1 PL的分子结合机制

PL已进行全序列测定，由449个氨基酸组成，具有N端和C端结构域。N端结构域包含酰基酶催化三联体（Ser153, Asp177和His264），以及潜在的底物结合位点（Phe78, His152, Phe216, Ile79, Trp253和 Arg257）。其他常报道的脂肪酶结合残基包括 Tyr115, Leu154, Ala179和 Pro181。肽-酶复合物的最优构象如图7a–e所示。五种降胆固醇肽与PL残基之间的相互作用主要涉及常规氢键和碳-氢键，如对接图所示。其中，FSL、LNFP和PFRP主要通过氢键相互作用稳定，而YPPIATPF和LPFQ还与结合区域周围的多个非极性残基接触。此外，YPPIATPF还表现出阳离子-π静电相互作用。

在OP-1中，YPPIATPF与Ser195和Val325形成氢键，而FSL则与Asp196和Glu188形成氢键。尽管这些残基不属于经典PL催化位点或结合位点（如Ser153和Asp177），但氢键仍可能有助于肽结合的稳定性，并增强肽-酶复合物的亲和力，从而潜在地抑制酶活性。此外，作为PL上极性且带负电荷的表面残基，Asp196和Glu188可能与肽的侧链形成稳定的氢键相互作用，从而促进酶抑制。YPPIATPF也位于结合区域附近的Pro194、Arg164和Val322残基附近，这可能有助于稳定肽-PL复合物。此外，YPPIATPF 与 Glu188 和 Asp287 之间存在阳离子-π静电相互作用，这可能通过与PL表面带负电区域相互作用而进一步稳定肽的结合，并有助于其抑制效应。

在OP-2中，分子对接显示LPFQ C端的谷氨酰胺（Q）与PL的催化残基His264形成常规氢键。此外，Phe216位于结合口袋中LPFQ的苯丙氨酸残基附近，提示这种非极性微环境可能有助于结合构象的稳定性。这种相互作用表明，LPFQ可能通过直接结合酶的活性位点来抑制酶活性，代表一种经典的抑制机制。Ala261、Phe259和Val260也被鉴定为相互作用残基；尽管这些残基并非典型的催化或底物结合残基，但它们可能对间接抑制PL有贡献。Val260与LPFQ形成氢键相关接触，而Phe216位于肽结合区域附近，可能有助于局部非极性结合环境。这些发现表明，LPFQ可能通过与催化和非催化残基的相互作用产生双重抑制效应：直接干扰His264可能降低酶活性，而与其他非催化残基的相互作用可能诱导构象变化从而导致间接抑制。对于LNFP，天冬酰胺（N）和C端脯氨酸（P）是关键残基，分别与PL的Val322和Asp287形成氢键。值得注意的是，Val322此前已被Xiang Huan等人报道与从沙棘籽中提取的降胆固醇肽（如FR、APYR、EEAASLR、NLLHR和RDR）相互作用，这支持了LNFP潜在的抑制活性。

在OP-3中，Val322仍然是肽PFRP的关键相互作用位点，而Asn167和Ser195等其他残基也形成重要的极性氢键以增强肽的结合。此外，Thr221、Pro194和Ser323参与氢键网络，表明肽与PL之间的结合涉及多部位协同机制，而非依赖单一残基。

因此，本研究确认了几种源自牡蛎水解物的新型PL抑制肽，这些肽主要通过占据催化结合位点来抑制PL活性。这些肽与PL的结合能范围为-7.2 kcal/mol至-8.5 kcal/mol，低于源自短角鳃金龟幼虫的VPPP、KYPF和YPGFGK。其中，LPFQ与PL的对接得分最低，表明其可能具有较强的相互作用。然而，其确切的抑制效力和机制需要进一步的动力学验证。

为进一步阐明抑制机制，我们将肽段的对接构象与PL已知的底物结合区域进行了比较。分析表明，LPFQ直接与催化残基His264结合，并占据由Phe216等残基构成的疏水口袋，由于其与底物结合位点存在显著重叠，因此可能作为竞争性抑制剂发挥作用。相比之下，YPPIATPF、FSL、LNFP和PFRP结合在催化结构域的表面位点（例如与Val322、Glu188、Asp196相互作用），这些位点与催化三联体和主要底物通道不同。这种不同于催化三联体的结合方式使我们推测它们可能通过非竞争性或变构机制起作用，这一假设有待通过酶动力学研究进行实验验证。

6.2 CE的分子结合机制

CE与筛选出的肽之间的最佳肽-酶复合物构象如图7f–j所示。CE以二聚体形式存在，具有两个相对的催化沟槽。催化三联体由Ser194、His435和Asp320组成。在催化区域中，Gly107和Ala108的主链酰胺基团与Ala195的酰胺基团相互作用形成潜在的氧阴离子孔，这对稳定催化过程中形成的四面体中间体起着至关重要的作用。对人和大鼠胰腺CE的研究强调了周围酸性残基在促进质子转移中的重要性，这对于酶在脂质代谢中的作用至关重要。这些残基包含在活性位点内，加上覆盖环的动态运动，确保了最佳的底物结合和催化周转。这在胆盐激活脂肪酶的研究中得到了进一步证实，其中胆盐结合调节酶活性。这些发现为理解CE催化效率背后的分子机制提供了更深入的见解。

在OP-1中，FSL与CE催化位点的Ser194和His435残基形成氢键，并与结合位点的Gly107和Ala108残基结合。此外，还观察到FSL与Phe324之间存在π-π堆积作用。Phe324是CE第二个烷基链结合位点的一部分，在胆固醇结合中起关键作用。因此，能够与CE两个烷基链结合区域相互作用的肽类有望成为有前景的CE抑制剂。特别是，与 His435 和 Phe324 结合的肽作为CE抑制剂具有特殊意义。例如，骆驼奶蛋白肽 CLSPLQFR 和 FCCLGPVPP与这些特征性残基表现出多种相互作用，显示出较高的 CE 抑制活性。研究表明，一些标准的CE抑制剂也能与远离主要热点区域的残基结合，包括Gly106、Gly112、Tyr125、Glu193、Trp227、Met281、Leu282、Val285、Ile323、Phe324、Ile327和Leu329。FSL与Gly106和Tyr125形成氢键，并与Trp227发生π-π堆积相互作用，这表明其可能作为CE抑制剂。尽管YPPIATPF不与任何经典的CE催化或结合残基结合，但它与Leu282形成氢键，提示它也可能表现出CE抑制活性。YPPIATPF与Leu282形成氢键，并与非经典残基（如Lys231、Gln230、Phe235、Phe351、Val391、Leu224、Leu527、Ile229和Pro300）相互作用，这表明CE抑制可能不仅限于活性位点。这一发现与Mudgil等人提出的假设一致，他们认为不同药物和肽对CE的抑制可能涉及多种相互作用模式。

在OP-2中，分子对接分析显示肽LNFP与CE发生多种相互作用，表明其与酶活性位点紧密结合。LNFP与CE活性位点广泛相互作用。N端亮氨酸（L）和苯丙氨酸（F）至关重要，它们与构成氧阴离子穴的Gly106、Gly107和Ala108形成氢键。此外，苯丙氨酸（F）还与Phe324和Trp227发生π-π堆积。这些相互作用增强了肽对CE的亲和力，特别是在催化和结合区域，可能有助于酶抑制或调节。此外，LNFP与Phe324和Trp227发生π-π堆积相互作用，表明肽中的芳香族基团通过与CE中的芳香族残基相互作用来增强结合稳定性。LNFP还与His435和Val285发生疏水相互作用，这可能增强整体结合。此类疏水相互作用通常促进肽与酶疏水表面区域的稳定结合。相比之下，LPFQ仅与一个特征性CE残基Trp227形成氢键。

肽PFRP通过范德华力与CE的Ser194和His435残基相互作用，表明其具有良好的空间互补性和结合亲和力。此外，该肽与Gly106、Gly107和Tyr125形成氢键，稳定了其与CE活性位点的结合，并可能调节催化活性。CE活性位点被一种保护性结构屏蔽，该结构在底物结合和酶调控中起重要作用。特别是活性位点周围的几个酸性残基（如Glu193、Asp434、Asp437和Asp438）部分埋藏且靠近His435。这些酸性残基可能在催化过程中增强His435的质子转移能力，从而提高CE的催化效率。值得注意的是，肽PFRP与Glu193形成氢键，进一步增强了其与酶的结合稳定性。作为关键酸性残基，Glu193可能在调控酶活性中起关键作用，其与PFRP的相互作用可能通过抑制或调节其活性来影响CE功能。

通过比较肽结合位点与底物结合腔，推断了CE的抑制机制。FSL、LNFP和PFRP直接与催化三联体（Ser194/His435）和/或氧阴离子穴（Gly106/Gly107/Ala108）相互作用，并占据关键底物结合残基Phe324和Trp227，完全阻断了底物进入通道。这种结合模式强烈表明它们作为竞争性抑制剂发挥作用。相反，YPPIATPF结合远离活性中心的Leu282，而LPFQ仅与Trp227外围相互作用，它们可能通过非竞争性机制发挥作用。

此外，对最终确定的五个活性肽（YPPIATPF、FSL、LPFQ、LNFP、PFRP）在所有三个馏分中的基于文本的序列比对进行了分析，以探索保守残基。分析显示，所有五个肽均含有苯丙氨酸（F），其中大部分还含有脯氨酸（P，4/5）和亮氨酸（L，3/5）。更重要的是，每个肽的N端均为疏水性或芳香族氨基酸（Y、F、L、P、L）。这一发现与第2.4.2节中先前的讨论高度一致：N端疏水性/芳香族残基（尤其是亮氨酸和苯丙氨酸）可增强与PL表面疏水区域的结合，从而提高抑制效果。苯丙氨酸的芳香环可参与π-π堆积相互作用（如第2.6.2节中LNFP与CE的Phe324和Trp227的相互作用），而脯氨酸有助于肽链稳定性。这些活性肽中的保守残基强化了我们的构效关系论点：N端的疏水性特征，结合富含苯丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸的序列，构成了牡蛎来源降胆固醇肽双重酶抑制活性的关键结构基序。

7 合成肽对HepG2细胞的细胞毒性评价

在解释降胆固醇作用之前，排除非特异性细胞毒性至关重要。使用CCK-8法评估了所有五种合成肽（FSL、YPPIATPF、LPFQ、LNFP、PFRP）在测试浓度范围（5–50 μmol/L）内对HepG2细胞经24小时处理后的存活率。

如图8所示，在任何浓度下，与溶剂对照组相比，所有肽均未引起细胞存活率的统计学显著降低（P>0.05）。所有处理组的细胞存活率均保持在95%以上。

8 合成肽在HepG2细胞中的降胆固醇作用

8.1 合成肽对总细胞胆固醇含量的影响

在确定这些肽在工作浓度下无细胞毒性（第2.7节）后，我们接下来评估了它们对细胞内胆固醇水平的影响。为了确认通过肽组学和分子对接鉴定出的这些肽是否确实有助于降低胆固醇，我们对其进行了化学合成，并在高胆固醇细胞模型中使用HepG2细胞测试了其效果。结果如图9所示，虽然LPFQ未产生显著反应，但随着五种肽浓度的增加，总细胞胆固醇总体呈下降趋势

其中，LNFP 表现突出——仅在 25 μmol/L 浓度下就显示出明显的降胆固醇效果，使其成为该组中最有效且起效最快的化合物。FSL 和 PFRP 也表现良好，但 YPPIATPF 和 LPFQ 需要更高剂量才能发挥全部作用。这与我们在早期与 CE 相关的分子对接研究中观察到的结果一致。

有趣的是，LNFP 在细胞中的表现优于 LPFQ，尽管 LPFQ 与 PL 的对接得分略高。这种对接预测与细胞效力之间的差异可能由多种因素导致。首先，对接得分来自静态计算模型，它们并不总是能反映蛋白质在真实细胞环境中的运动、与水的相互作用或随时间的行为。对接能量上的微小优势不一定意味着在活细胞中表现更好。其次，肽类在细胞外的稳定性以及它们与培养基中蛋白质的结合程度可能存在差异。如果一种肽能够抵抗降解或避免被血清蛋白捕获，它就可能保持更长时间的活性和更高浓度。最后，一些肽可能通过其他途径影响胆固醇——而不仅仅是阻断 PL。例如，LNFP 可能会影响细胞摄取或清除胆固醇的方式，或影响调控脂质代谢的信号通路。因此，在考虑这些额外因素时，其在细胞中的更强效果就说得通了。

总体而言，我们的研究表明，像LNFP 和 FSL 这样的肽类——最初在生化测试中通过抑制 PL 和 CE 显示出潜力——在活细胞模型中也能发挥作用，可降低肝细胞内的胆固醇。这表明它们的降胆固醇作用不仅限于阻断肠道中的消化酶。这些小肽或其降解产物在被吸收后可能到达肝脏，在那里影响胆固醇合成或摄取等关键过程。例如，尽管 LNFP 的对接得分不高，但其优越的细胞活性可能源于其在生物环境中的更好稳定性或对肝脏特异性胆固醇通路的更强影响。

8.2 通过油红O染色观察合成肽对细胞脂质积累的影响

为直观评估合成肽对HepG2 细胞中脂质积累的影响，我们采用油红O染色法分析了不同浓度肽处理后的细胞（图 10）。与高胆固醇模型组相比，经活性肽处理的细胞表现出不同程度的细胞内脂滴减少。

LNFP处理组表现出最显著的脂质降低效果，特别是在25 μmol/L和50 μmol/L浓度下，细胞内红色脂滴信号明显减弱，与TC测定结果高度一致（图9d）。FSL和PFRP也显示出明显的剂量依赖性脂滴减少趋势。相比之下，YPPIATPF和LPFQ仅在较高浓度（50 μmol/L）下表现出可见的脂质积累抑制作用，这与其细胞胆固醇测定结果一致。

8.3 合成肽对肝细胞LDL摄取的影响

基于油红O染色实验的结果，我们选择了三种活性相对较好的肽（FSL、LNFP和PFRP）。为进一步探究这些肽调节肝细胞胆固醇代谢的机制，我们评估了它们对HepG2细胞LDL摄取能力的影响。如图11所示，在用不同浓度（5–50 μmol/L）的FSL、LNFP和PFRP处理细胞后，其LDL摄取能力呈现出显著的剂量依赖性增强。

在定量结果（图11a-c）中，与模型组相比，LNFP组在25 μmol/L和50 μmol/L浓度下的LDL摄取率分别增加了约35%和42%，显著高于模型组（P < 0.05），且与10 μmol/L辛伐他汀阳性对照组的效果相当。FSL和PFRP也表现出类似趋势，但在同等浓度下的增加幅度略低于LNFP。荧光显微镜图像（图11d–f）直观地显示，经肽处理的细胞中Dil-LDL荧光信号显著增强，表明细胞对LDL的内吞作用增加。此外，图11g展示了50 μmol/L肽处理组与模型组、对照组和辛伐他汀组比较的LDL摄取效果代表性荧光图像。该面板旨在提供与阳性对照更直接的视觉比较，以展示最佳肽浓度的效果。

9 潜在机制的综合讨论

我们的研究通过基于实验室和细胞实验的坚实证据表明，OPs有助于降低胆固醇。通过整合酶测试、计算机建模和细胞胆固醇测量的结果，我们开始看到这些肽类发挥作用的多种互补方式。

最有力支持的机制是它们在肠道中的直接作用，其中它们干扰消化脂肪和胆固醇的酶。根据分子对接构象，我们可以对它们的抑制模式进行假设：像LPFQ这样的肽直接占据催化位点（例如与PL的His264相互作用），预计会作为竞争性抑制剂起作用。相比之下，像YPPIATPF这样的肽结合到外周位点，据推测通过非竞争性或变构机制发挥作用。这为它们限制膳食脂质和胆固醇肠吸收的能力提供了强有力的机制依据。

同时，我们在肝细胞中观察到的强效降胆固醇作用——尤其是肽LNFP——提示存在额外的吸收后机制。细胞内总胆固醇和脂滴减少（通过油红O染色可视化）证实了肝细胞中的直接降血脂效应。关键的是，我们新发现LNFP显著增强LDL的细胞摄取（图11），揭示了一种特定的肝脏机制：低密度脂蛋白受体（LDLR）活性可能上调。这种效应与他汀类药物的关键作用相似，并为清除循环低密度脂蛋白胆固醇提供了一条可行途径，这与肠道酶抑制不同。重要的是，观察到的降胆固醇效果并非由细胞毒性引起，因为在所有肽处理下，细胞活力均保持不受损害（图8）。

综上所述，我们的研究结果指向OPs降胆固醇作用的双通路模型。途径A（肠道）：肽可能作为磷脂酶/胆固醇酯酶（PL/CE）抑制剂，减少膳食脂质吸收。途径B（肝脏）：肽（或其生物活性代谢物）可能直接调节肝脏胆固醇稳态，如增强LDL摄取所证明的那样，从而促进胆固醇清除。这些途径可能是协同作用的。

区分证据水平至关重要：酶抑制活性直接得到体外实验支持；细胞有效性通过HepG2模型确认；而抑制的精确分子机制（竞争性vs非竞争性）仍为计算推导的假设，需要未来的动力学验证。接下来，我们将阐述这一整体图景——区分数据强烈支持的内容以及未来研究仍需解决的开放问题。

将我们的研究结果置于更广泛的胆固醇稳态框架中进行背景化是重要的。正如引言中所指出的，胆固醇调节涉及吸收、合成、运输和排泄。本研究通过体外酶抑制系统地解决了吸收方面，并通过LDLR调控揭示了有前景的肝脏清除机制。我们未对其他潜在影响（例如HMGCR的合成或NPC1L1的运输）进行实验研究。因此，虽然我们的研究阐明了两个重要机制并揭示了有前景的细胞有效性，但它也为后续研究开辟了道路，以绘制OPs与复杂胆固醇调节网络之间全部相互作用的图谱。

10 局限与未来展望

我们的研究结果凸显了OP组分OP-2及其衍生肽（尤其是LPFQ和LNFP）在降低胆固醇方面的良好活性，这在酶抑制试验和细胞模型中均有体现。尽管如此，我们应指出当前工作的两个关键限制：首先，肽的拟议抑制机制（竞争性与非竞争性）主要基于分子对接模拟推断，尚未通过酶动力学实验得到证实。其次，我们尚未测试这些肽在模拟胃肠道消化条件下的稳定性。第三，关于阳性对照的选择：(a) 在细胞实验中，辛伐他汀（一种HMGCR抑制剂）被用作阳性对照，因其已知的降胆固醇作用，为评估我们的肽在HepG2细胞中的整体功效提供了治疗基准。我们承认其作用机制与我们肽提出的PL/CE抑制机制不同，因此比较的是表型结果，而非分子靶点。(b) 我们已明确CE抑制试验中使用的是已知的CE抑制剂，而非奥利司他，以确保特异性。对于最初描述CE试验方案时的疏忽所造成的任何混淆，我们深表歉意。

关于第一个限制，分子对接提供了宝贵的结构见解，但无法明确表征动态抑制模式或提供定量抑制常数（Ki）。因此，我们的机制分类应被视为合理的预测，以指导后续验证。

关于第二个限制，胃蛋白酶和胰蛋白酶等消化酶可能会分解肽结构，进而影响其生物活性。因此，在通过口服摄入后完全确认其实际疗效之前，需要进一步的研究——包括基于实验室的消化模型和最终的动物试验——来验证其稳定性和生物利用度。

值得注意的是，我们鉴定的一些活性肽含有结构特征（如脯氨酸和疏水残基），这些特征通常与更好的抗酶解能力相关。展望未来，我们计划重点关注三个方向：

阐明精确的抑制机制：通过进行酶动力学研究，确定先导肽的抑制模式和抑制常数（Ki）。

评估胃肠道稳定性：通过研究这些候选肽在模拟消化过程中的行为。评估体内功效：通过考察它们的吸收效果，以及是否在活体动物模型中产生显著的降脂作用。

结 论

综上所述，本研究结合肽组学与生物信息学，阐明了降胆固醇作用中OPs的构效关系。通过IEC分离得到的OP-2组分对PL（76.16%）和CE（66.43%）表现出最强的抑制活性。这种活性归因于其独特的理化特性：高疏水性、低等电点以及富含酸性残基。肽组学分析表明，OP-2中的活性成分主要为富含疏水和芳香族氨基酸的小肽（<3 kDa）。分子对接进一步确定了两种双重酶抑制肽LPFQ和LNFP，它们分别与PL和CE的催化位点相互作用。关键的是，这些合成肽在HepG2细胞中显示出显著的降胆固醇效果，其中LNFP在50 µmol/L浓度下达到的效果与辛伐他汀相当。总之，我们的研究结果表明，OPs（尤其是OP-2组分）主要通过直接抑制关键消化酶（PL和CE）发挥降胆固醇作用，而其在肝细胞中的活性提示其可能具有多靶点功能。本研究为未来这些有前景的生物活性肽的胃肠道稳定性和体内机制研究提供了坚实基础。

引文格式：

张烘煜, 王禹鸥, 陈忠琴, 等. 降胆固醇牡蛎肽的构效关系解析：肽组学与生物信息学整合研究[J]. 食品科学, 2026, 47(11): 78-98. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251112-091.

ZHANG Hongyu, WANG Yu’ou, CHEN Zhongqin, et al. Deciphering the structure-activity relationships of cholesterollowering oyster peptides: an integrated peptidomics and bioinformatics study[J]. Food Science, 2026, 47(11): 78-98. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251112-091.

实习编辑：王雨婷；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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