Acta Pharmacol Sin (IF=10.396)｜绿原酸靶向Keap1激活Nrf2，促进肝细胞增殖与代谢重塑，加速肝再生！

2026年3月，上海中医药大学中医药功能物质发现与利用全国重点实验室、上海中医药大学中药研究所季莉莉研究员、魏梦娟教授团队在Acta Pharmacologica Sinica（JCR 1区，IF=10.395） 在线发表题为 “Chlorogenic acid promotes liver regeneration after partial hepatectomy through activating Nrf2 via directly targeting Keap1” 的研究论文。该研究围绕天然活性成分绿原酸（chlorogenic acid，CGA）促进肝脏再生的分子机制展开，发现绿原酸能够通过直接靶向Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1），激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号通路，从而促进部分肝切除术后的肝组织修复。

肝脏是人体内再生能力最强的器官之一，在受到损伤或部分切除后能够通过肝细胞增殖和代谢重塑恢复组织结构与功能。然而，在临床上，大范围肝切除、肝移植以及严重肝损伤后，肝再生不足仍可能导致肝功能衰竭和小肝综合征等严重并发症。目前，临床上仍缺乏能够有效促进肝再生的药物干预策略。

绿原酸是传统中药杜仲中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎以及肝保护等多种生物学功能。既往研究发现，绿原酸能够通过激活Nrf2缓解药物诱导的急性肝损伤，但其是否能够促进肝切除后的再生过程，以及其中涉及的分子机制尚未明确。

本研究发现，绿原酸能够显著促进70%和90%部分肝切除小鼠模型中的肝脏再生，提高肝脏指数，并促进肝细胞增殖。进一步机制研究显示，绿原酸能够直接结合Keap1蛋白，解除Keap1对Nrf2信号通路的抑制作用，促进Nrf2进入细胞核并发挥转录调控功能。

在下游机制方面，研究发现激活后的Nrf2能够通过促进转录因子E2F1表达，加速肝细胞由静息状态进入细胞周期，增强Cyclin E1等细胞周期相关蛋白表达，从而促进肝细胞增殖。同时，Nrf2还能诱导PGC-1α表达，进一步激活脂肪酸氧化过程，提高ATP生成，为快速增殖的肝细胞提供充足的能量支持。

为了进一步验证Keap1/Nrf2信号轴的重要作用，研究团队利用Nrf2基因敲除小鼠以及肝脏特异性Keap1敲除小鼠进行验证。结果显示，在缺失Nrf2或Keap1调控作用异常的情况下，绿原酸促进肝再生的作用明显减弱，进一步证明Keap1/Nrf2通路是绿原酸发挥促再生功能的核心机制。

此外，研究团队通过蛋白芯片筛选、Biotin-CGA pull-down、分子对接、细胞热稳定性分析（CETSA）以及微量热泳动（MST）等多种技术手段，明确了绿原酸与Keap1蛋白之间存在直接相互作用，并发现Keap1 Kelch结构域中的Arg415残基是绿原酸结合并激活Nrf2的重要位点。

该研究揭示了天然产物绿原酸促进肝再生的新型作用机制，提出了“CGA–Keap1–Nrf2–E2F1/PGC-1α”调控网络在肝组织修复中的重要作用。该发现不仅拓展了Nrf2信号通路在肝再生过程中的功能认识，也为开发促进肝切除术后恢复的天然药物干预策略提供了新的理论依据。

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【摘 要】

肝脏具有强大的再生能力，但在部分肝切除、肝移植以及严重肝损伤后，肝再生不足仍是导致肝功能衰竭的重要原因。目前临床上尚缺乏有效促进肝再生的治疗策略。绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是传统中药杜仲中的主要活性成分，具有抗氧化和肝保护作用，但其在肝再生过程中的作用及分子机制尚未明确。

近日，研究团队发现，绿原酸能够显著促进70%和90%部分肝切除小鼠模型中的肝再生，提高肝脏指数，并促进肝细胞增殖。机制研究表明，CGA可直接结合Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1），解除其对核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）的抑制作用，促进Nrf2核转位及转录激活。进一步研究发现，激活的Nrf2一方面通过促进E2F1表达，加速肝细胞周期进程，促进肝细胞增殖；另一方面通过诱导PGC-1α表达，增强脂肪酸氧化和ATP生成，为肝再生提供充足能量支持。

该研究进一步利用Nrf2敲除小鼠和肝脏特异性Keap1敲除小鼠验证了Keap1/Nrf2信号轴在CGA促进肝再生过程中的关键作用，并通过蛋白互作分析、分子对接、CETSA及MST等实验明确了CGA与Keap1之间的直接结合关系，发现Arg415残基是二者相互作用的重要位点。

该研究揭示了绿原酸促进肝再生的新型分子机制，提出“CGA–Keap1–Nrf2–E2F1/PGC-1α”调控轴在肝组织修复中的重要作用，为开发促进肝切除术后恢复的天然药物干预策略提供了新的理论依据。

01

研究背景及科学问题

肝脏作为人体重要的代谢器官，具有独特的自我修复和再生能力。在肝部分切除（partial hepatectomy，PHx）或急性损伤后，残余肝组织能够通过肝细胞增殖、细胞周期激活以及代谢重编程等过程恢复肝脏体积和功能。然而，在临床实践中，大范围肝切除、肝移植以及严重肝损伤后，部分患者仍会因肝再生能力不足而发生肝功能衰竭、小肝综合征等严重并发症，显著影响患者预后。目前，临床上尚缺乏能够有效促进肝再生的药物干预手段，因此寻找新的促肝再生策略具有重要临床意义。

近年来，天然活性成分因具有多靶点调控和较好的生物安全性，逐渐成为促进组织修复和器官再生的重要研究方向。绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是传统中药杜仲中的主要活性成分之一，已有研究发现其具有抗氧化、抗炎以及肝保护作用。前期研究提示，CGA能够通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）减轻药物诱导的急性肝损伤，但CGA是否能够促进部分肝切除后的肝脏再生，以及其具体作用机制仍有待进一步阐明。

Nrf2是调控细胞氧化还原稳态的重要转录因子，在多种肝脏疾病过程中发挥关键作用。正常情况下，Nrf2受到Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）的负向调控，Keap1促进Nrf2降解，从而限制其转录活性。然而，在肝再生过程中，Nrf2除了参与抗氧化防御外，是否能够进一步调控肝细胞增殖以及能量代谢重塑，目前仍缺乏深入研究。

✍基于此，本研究提出以下科学问题：

第一，绿原酸是否能够促进部分肝切除后的肝脏再生？
研究需要明确CGA在不同程度肝切除模型中的促再生作用，并评价其对肝细胞增殖、细胞周期进程以及肝功能恢复的影响。

第二，Nrf2是否是绿原酸发挥促肝再生作用的关键调控因子？
研究需要阐明CGA是否通过激活Nrf2信号促进肝再生，并通过基因敲除模型验证Nrf2在该过程中的必要性。

第三，绿原酸如何激活Nrf2信号通路？是否存在直接作用靶点？
研究进一步探索CGA与Keap1之间的分子互作关系，明确CGA是否通过直接结合Keap1解除其对Nrf2的抑制作用。

第四，Nrf2激活后如何协调肝细胞增殖与代谢需求？
研究重点解析Nrf2下游调控网络，探索其是否通过调控E2F1促进细胞周期推进，并通过PGC-1α介导脂肪酸氧化和ATP生成，为肝再生提供能量支持。

综上，本研究围绕“天然活性成分如何调控肝再生”这一核心问题，系统揭示绿原酸通过靶向Keap1激活Nrf2，并进一步协调肝细胞增殖与能量代谢促进肝再生的分子机制，为开发促进肝组织修复的新型干预策略提供理论依据。

02

重要发现及亮点

绿原酸被发现可直接靶向Keap1激活Nrf2促进肝再生

研究首先围绕绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是否能够促进肝脏再生展开。研究者建立了90%和70%部分肝切除（partial hepatectomy，PHx）小鼠模型，并通过肝脏指数、生存率、组织学染色以及增殖标志物检测评价CGA对肝再生的影响。

结果显示，在90% PHx模型中，CGA处理显著提高小鼠生存率；在70% PHx模型中，CGA能够明显提高肝脏指数，加速肝组织恢复。同时，H&E染色显示CGA增加肝细胞有丝分裂数量，BrdU和Ki-67染色提示肝细胞增殖能力增强。此外，CGA促进PCNA、Cyclin D1和Cyclin E1等细胞周期相关蛋白表达，表明CGA能够有效促进部分肝切除后的肝细胞增殖。

这些结果证明，绿原酸具有促进肝再生的潜在作用，为进一步解析其分子机制奠定基础。

图1：绿原酸促进部分肝切除后的肝脏再生。
（A）90%部分肝切除模型中CGA对小鼠生存率的影响；（B）CGA处理后90% PHx小鼠肝脏恢复情况及肝脏指数变化；（C）70% PHx后不同时间点肝脏指数变化；（D）H&E染色检测肝细胞有丝分裂情况；（E）BrdU和Ki-67染色检测肝细胞增殖；（F-H）CGA对PCNA、Cyclin D1及Cyclin E1表达的影响。

Nrf2被鉴定为介导绿原酸促进肝再生的关键调控因子

为了探索CGA促进肝再生的潜在机制，研究者首先利用PHx患者肝组织转录组数据进行生物信息学分析，发现氧化应激相关通路以及Nrf2信号显著富集。随后，研究者检测CGA对Nrf2活性的影响。

结果发现，CGA并未改变Nrf2基因（Nfe2l2）的mRNA水平，而是促进Nrf2由胞浆向细胞核转移，增强Nrf2转录活性。同时，CGA显著促进Nrf2下游抗氧化基因Hmox1、Nqo1、Gclc和Gclm表达，改善肝脏氧化还原稳态，并降低ROS积累。

进一步利用Nrf2敲除小鼠进行验证发现，Nrf2缺失后，CGA促进肝脏指数恢复、肝细胞增殖以及PCNA表达升高的作用均明显消失。

这些结果表明，Nrf2是绿原酸发挥促肝再生作用的必要调控因子。

图2：Nrf2介导绿原酸促进肝再生过程。
（A）PHx相关转录组数据中Nrf2相关通路富集分析；（B）CGA对Nrf2核转位的影响；（C）CGA调控Nrf2下游抗氧化基因表达；（D）CGA对ROS水平及GSH/GSSG比例的影响；（E-H）Nrf2敲除小鼠验证Nrf2在CGA促进肝再生中的关键作用。

Nrf2通过调控E2F1促进肝细胞周期推进

由于肝再生依赖于肝细胞重新进入细胞周期，研究者进一步探索Nrf2如何调控肝细胞增殖过程。

研究发现，CGA处理能够显著促进E2F1表达及核转位，而这一作用在Nrf2敲除小鼠中消失。进一步分析发现，E2F1作为重要细胞周期调控转录因子，可促进Cyclin E1、Cyclin A2以及Cyclin B1等细胞周期相关基因表达。

通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验，研究者发现Nrf2能够直接结合E2F1启动子区域，并促进其转录表达。

上述结果揭示了一条新的促再生调控轴：

CGA → Nrf2激活 → E2F1表达增强 → 细胞周期推进 → 肝细胞增殖增加

说明Nrf2不仅参与抗氧化反应，还能够直接调控肝细胞增殖过程。

图3：Nrf2通过促进E2F1表达加速肝细胞周期进程。

（A-B）CGA对Cyclin D1和Cyclin E1表达的影响；（C-D）CGA促进E2F1表达及核转位；（E）Nrf2结合E2F1启动子区域的ChIP分析。

Nrf2通过PGC-1α介导代谢重塑，为肝再生提供能量支持

肝再生过程中，快速增殖的肝细胞需要大量ATP供应。研究者进一步探讨CGA是否能够通过调控代谢过程支持肝再生。

研究发现，CGA处理后，肝脏脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）能力明显增强，同时ATP水平升高。进一步研究显示，CGA促进PPARα核转位，并提高Cpt1a、Acads、Acadm等脂肪酸氧化相关基因表达。

机制研究发现，CGA并非直接调控PPARα，而是通过Nrf2促进PGC-1α表达。ChIP实验进一步证实，Nrf2能够结合Ppargc1a启动子区域，促进PGC-1α转录。

在Nrf2缺失条件下，CGA诱导的PGC-1α表达、脂肪酸氧化增强以及ATP生成增加均被显著削弱。

这些结果说明，Nrf2通过PGC-1α介导代谢重塑，为肝细胞增殖提供必要能量支持。

图4：Nrf2通过PGC-1α促进脂肪酸氧化和ATP生成。
（A-B）CGA对肝脏脂肪酸氧化能力和ATP水平的影响；（C-D）CGA促进PPARα核转位及FAO相关基因表达；（E-I）Nrf2调控PGC-1α表达及其启动子结合分析。

绿原酸被证实直接结合Keap1并激活Nrf2信号

为了明确CGA激活Nrf2的直接作用靶点，研究者利用蛋白芯片筛选CGA结合蛋白。

结果发现，Keap1可能是CGA的重要靶蛋白。随后，通过Biotin-CGA pull-down实验验证CGA能够直接结合Keap1。分子对接和分子动力学模拟显示，CGA可结合Keap1 Kelch结构域，并形成稳定相互作用。

进一步利用细胞热稳定性分析（CETSA）以及微量热泳动（MST）实验验证发现，CGA能够增强Keap1蛋白稳定性，并与Keap1产生直接结合，其结合位点集中于Kelch结构域，其中Arg415残基发挥关键作用。

这些结果明确揭示了CGA激活Nrf2的直接分子机制。

图5：绿原酸直接结合Keap1激活Nrf2信号。
（A）CGA结合蛋白筛选；（B）Biotin-CGA pull-down验证CGA与Keap1结合；（C）CGA与Keap1分子对接分析；（D）分子动力学模拟；（E）CETSA验证CGA对Keap1稳定性的影响；（F）MST检测CGA与Keap1结合能力。

Keap1/Nrf2信号轴介导绿原酸促进肝再生作用

为了进一步验证Keap1/Nrf2信号通路在CGA促进肝再生过程中的作用，研究者构建了肝脏特异性Keap1敲除小鼠模型。

结果显示，在正常Keap1表达的小鼠中，CGA处理能够显著提高70%部分肝切除后的肝脏指数，并增加肝细胞有丝分裂数量、BrdU阳性细胞和Ki-67阳性细胞比例，同时促进PCNA和Cyclin E1等增殖相关蛋白表达。

然而，在肝脏特异性Keap1敲除小鼠中，Keap1缺失本身即可促进部分肝切除后的肝脏再生，而CGA处理未能进一步增强肝脏指数恢复及肝细胞增殖水平。此外，CGA促进E2F1和PGC-1α表达的作用在Keap1缺失背景下也明显减弱。

上述结果表明，Keap1是CGA发挥促肝再生作用的重要调控靶点，CGA需要通过调控Keap1/Nrf2信号轴发挥促进肝细胞增殖和代谢重塑的作用。

图6：Keap1/Nrf2信号轴介导绿原酸促进肝再生作用。

（A-D）肝脏特异性Keap1敲除小鼠中CGA对肝脏指数、肝细胞有丝分裂、BrdU和Ki-67阳性细胞以及增殖相关蛋白表达的影响；（E-G）Keap1缺失对CGA调控E2F1、PGC-1α表达以及脂肪酸氧化和ATP水平的影响。

Arg415是绿原酸结合Keap1并激活Nrf2信号的关键位点

在明确Keap1是绿原酸（CGA）发挥促肝再生作用的重要靶点后，研究者进一步解析CGA与Keap1相互作用的分子基础，以确定二者结合的关键结构位点。

首先，研究者通过分子对接模拟分析CGA与Keap1 Kelch结构域的结合模式。结果显示，CGA能够结合于Keap1的Nrf2结合区域，并与多个关键氨基酸残基形成相互作用，包括Gly367、Arg415、Val418、Val465、Val512、Ala556和Ile559等。

随后，研究者利用虚拟突变分析筛选可能影响CGA-Keap1结合的关键残基。结果发现，仅Arg415突变为丙氨酸（Arg415Ala）能够显著削弱CGA与Keap1之间的结合稳定性，提示Arg415可能是CGA识别Keap1的重要作用位点。

进一步通过分子动力学模拟发现，野生型CGA-Keap1复合物在模拟过程中保持较好的稳定性，而Arg415突变后的复合物稳定性明显降低。

为了进一步验证这一预测结果，研究者分别构建Keap1全长（Keap1full）、Arg415突变体（Keap1Δ415）以及Ile559突变体（Keap1Δ559），并在细胞中进行功能验证。

结果显示，在表达野生型Keap1或Ile559突变体的细胞中，CGA无法明显增强Nrf2转录活性；而在Arg415突变背景下，CGA诱导的Nrf2转录活性增强作用得以恢复。同时，在Keap1缺失细胞中重新表达不同Keap1突变体后发现，Arg415突变显著降低了CGA与Keap1的结合能力，并削弱CGA诱导的Nrf2蛋白表达升高。

这些结果证明，Keap1 Kelch结构域中的Arg415残基是CGA结合Keap1并激活Nrf2信号通路的关键分子基础。

图7：Arg415是绿原酸结合Keap1并激活Nrf2信号的关键位点。

（A）CGA与Keap1 Kelch结构域结合模式及关键氨基酸残基分析；（B）CGA-Keap1复合物及Arg415突变复合物的分子动力学模拟；（C）Keap1突变体对CGA诱导Nrf2转录活性的影响；（D）Keap1突变体对CGA与Keap1结合能力的影响；（E）Keap1突变体对CGA诱导Nrf2表达的影响。

【贡献】★★★★★

肝脏再生是维持肝脏功能和促进损伤修复的重要生理过程，其过程不仅依赖肝细胞增殖，还需要精确协调氧化应激调控、细胞周期进展以及能量代谢重塑。尽管Nrf2长期以来被认为是调节抗氧化防御的重要转录因子，但其在肝再生过程中是否参与细胞增殖和代谢调控仍缺乏系统研究。

本研究发现，天然活性成分绿原酸（chlorogenic acid，CGA）能够显著促进部分肝切除后的肝脏再生，并揭示了其新的作用机制。研究表明，CGA并非通过简单增强Nrf2表达发挥作用，而是直接结合Keap1蛋白，解除Keap1对Nrf2的抑制作用，从而促进Nrf2核转位和转录激活。

进一步研究发现，激活后的Nrf2具有双重调控作用：

一方面，Nrf2通过促进E2F1转录，增强Cyclin E1等细胞周期相关蛋白表达，加速肝细胞进入增殖阶段；

另一方面，Nrf2通过促进PGC-1α表达，增强脂肪酸氧化过程，提高ATP生成水平，为肝再生提供充足的能量支持。

因此，本研究提出了一种新的肝再生调控模式：

绿原酸 → Keap1结合 → Nrf2激活 → E2F1介导细胞增殖 + PGC-1α介导代谢重塑 → 肝再生增强

该研究不仅揭示了绿原酸促进肝组织修复的分子机制，也拓展了对Keap1/Nrf2信号通路功能的认识，提示天然产物靶向Keap1/Nrf2轴可能成为促进肝脏修复和治疗肝功能不足的新策略。

未来研究仍需进一步探索CGA在不同类型肝损伤模型中的治疗潜力，以及其在临床转化过程中的安全性、有效剂量和应用价值。

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