如何降低流式细胞术中的高背景信号？

流式细胞术中的背景信号过高，会增加阳性与阴性细胞群体的区分难度，影响门控设置和实验结果的判读。遇到这种情况时，不必急于更换抗体，更重要的是先确定背景信号来自哪里。

常见原因包括抗体浓度过高、Fc受体介导的非特异性结合、死细胞、自发荧光、洗涤不充分以及仪器参数设置不当。按照以下步骤逐一排查，可以更有针对性地改善染色结果。

1. 判断背景信号来自细胞还是抗体

首先，应将实验样本与适当的对照进行比较，以区分细胞自身的背景荧光和染色试剂引入的额外信号。

· 未染色对照： 用于观察样本的基础自发荧光，并评估相关检测通道中的背景水平。

· 抗体染色样本： 反映特异性结合、非特异性结合与细胞自发荧光共同产生的信号。

· 仅二抗对照： 适用于间接染色实验，用于判断二抗是否产生非特异性信号。

· 适当的阴性对照或生物学对照： 用于判断观察到的染色模式是否符合预期的靶标表达情况。

如果未染色细胞已经表现出较高荧光，问题可能与细胞自发荧光或样本状态有关，而不一定是抗体结合造成的。如果染色后背景明显升高，则应进一步检查抗体浓度、非特异性相互作用及染色流程。

同型对照在某些实验中有助于评估非特异性抗体结合，但不能替代未染色对照或设计合理的生物学阴性对照。

Comparison of unstained, single-stained, FMO, and multicolor samples[1]

2. 优化抗体浓度，避免过量染色

抗体用量并非越高越好。当特异性结合逐渐达到饱和后，继续增加抗体用量可能增加非特异性染色和背景信号。

建议按以下步骤排查：

1. 参考产品说明书推荐的工作浓度或单次染色用量。

2. 设置一组不同的抗体浓度梯度，同时保持细胞数量、染色体积、孵育条件及其他实验变量一致。

3. 比较阳性与阴性细胞群体的分离程度，而不是单纯选择荧光强度最高的浓度。

4. 选择能够获得清晰群体区分且背景可接受的工作浓度。

最佳工作浓度会受到细胞类型、靶标表达水平、样本处理方式和抗体克隆等因素影响。在一种实验中表现良好的浓度，不一定适用于另一种实验条件。

如果不同浓度下的背景始终较高，应继续排查其他原因，而不是一味降低抗体用量。

Antibody titration and reduction of nonspecific binding[2]

Potential unwanted effects of Fc-blocking reagents[2]

3. 必要时进行 Fc 受体封闭

部分免疫细胞表面的 Fc 受体可以与抗体的 Fc 区结合，而不依赖抗体对目标抗原的特异性识别。这种结合可能产生非预期的染色信号，尤其是在含有单核细胞、巨噬细胞、B 细胞或其他 Fc 受体表达细胞的样本中。

建议的排查方法：

· 根据样本物种和细胞类型，考虑使用合适的 Fc 受体封闭试剂。

· 按照试剂说明书进行封闭处理。

· 在其他实验条件一致的情况下，比较封闭前后的染色结果。

· 如果使用间接染色，还应检查二抗是否存在非特异性结合。

Fc 受体封闭对于免疫细胞样本中的非特异性染色尤其值得考虑，但并非所有背景问题都能通过封闭解决。如果背景主要来自自发荧光、死细胞或抗体浓度过高，仅进行 Fc 封闭可能无法改善结果。

Comparison of Fc receptor-blocking approaches[2]

4. 检查细胞活率与样本质量

死亡或受损细胞可能更容易发生非特异性结合，也可能表现出较高的自发荧光。此外，细胞碎片和细胞聚集也会增加群体识别和门控分析的难度。

在更换抗体之前，应先检查细胞悬液的质量。

建议重点检查以下方面：

· 尽可能使用新鲜制备的样本，减少不必要的操作和长时间存放。

· 染色前评估细胞活率，尤其是原代细胞和组织来源样本。

· 根据实验设计加入适用的活死细胞染料。

· 通过合适的散射信号和单细胞门控排除细胞碎片及聚集体。

· 如果细胞活率较低，应优先优化样本制备流程，而不是仅依靠门控排除受损细胞。

活死细胞染料有助于区分活细胞和死细胞，但必须根据染色及固定方案选择合适的试剂。对于需要固定的实验，还应确认染料与固定流程兼容。

5. 优化洗涤步骤并检查染色流程

洗涤不充分可能导致未结合的抗体或其他染色试剂残留在样本中。如果染色后背景明显增加，尤其是在采用间接检测时，应重点检查洗涤流程。

建议检查以下环节：

· 确认染色后是否按照实验方案完成了足够的洗涤次数。

· 根据样本量和细胞数量，使用适当体积的洗涤缓冲液。

· 充分重悬细胞沉淀，同时避免过度操作造成细胞损伤。

· 对于胞内染色，确认固定、通透和洗涤步骤适用于目标蛋白及所用抗体。

胞内染色中，未结合试剂去除不充分或细胞内染色试剂残留，可能导致非预期信号。不过，不应在流式洗涤缓冲液中随意添加 Tween-20 或 Triton X-100 等去污剂。这些试剂可能影响细胞膜结构和抗原检测，尤其是在细胞表面染色实验中。

如果背景只在固定或通透后出现，应重点比较样本处理步骤，并确认所用试剂与目标抗原兼容。

An investigation of beneficial and detrimental effects of monocyte blocking reagents[2]

6. 检查自发荧光与仪器参数

背景荧光并不一定来自抗体的非特异性结合。部分细胞本身具有较强的自发荧光，样本处理也可能改变细胞的荧光特征。

此外，仪器参数设置也会影响不同细胞群体之间的区分程度。

建议从以下几个方面排查：

· 使用与染色样本相同的采集参数检测未染色细胞，比较基础荧光水平。

· 确认所使用的激光器和检测通道适合当前荧光信号。

· 检查探测器电压或增益设置，确保信号处于仪器可有效测量的范围内。

· 使用多种荧光染料时，检查补偿设置，并采用合适的单染对照进行验证。

· 如果某个通道中的自发荧光较高，可根据实验设计评估是否有可替代的荧光染料或检测通道。

荧光补偿用于校正不同荧光染料之间的光谱溢出，不能消除自发荧光或抗体的非特异性结合。同样，调整仪器参数可能改善信号显示，但无法从根本上解决染色特异性不足的问题。

Robust linear regression effectively estimates spillover coefficients[1]

7. 什么情况下应该考虑更换抗体？

如果已经检查样本质量、抗体浓度、封闭、洗涤和仪器设置，背景问题仍然存在，就有必要重新评估抗体本身是否适用于当前实验。

首先确认抗体是否经过流式细胞术应用验证，是否识别目标物种的抗原，以及是否适用于当前的样本类型和染色条件。抗体在 Western blot、免疫组化等应用中表现良好，并不意味着它一定适用于流式细胞术。

如果实验采用未偶联一抗与二抗的间接染色方式，还应检查二抗的物种特异性和交叉反应。条件允许时，可将染色结果与适当的阴性对照或已验证的抗体进行比较。

更换抗体应建立在系统排查的基础上，而不应成为遇到高背景时的第一反应。

常见问题

• 为什么流式细胞术阴性对照的荧光也很高？

如果未染色对照的荧光已经很高，可能与细胞自发荧光、样本状态不佳或仪器采集参数有关。如果阴性对照中加入了抗体，还应考虑非特异性结合和试剂相关背景。在调整染色方案之前，首先要明确出现高荧光的究竟是哪一种对照。

• 背景信号高是否说明抗体质量不好？

不一定。抗体浓度过高、Fc 受体结合、死细胞、自发荧光、洗涤不充分以及样本处理不当，都可能导致背景信号升高。在判断抗体本身是否存在问题之前，应先排查这些因素。

• 降低抗体浓度能解决高背景吗？

在过量抗体导致非特异性染色时，降低浓度可能有所帮助。但如果稀释过度，特异性信号也可能随之减弱。通过设置浓度梯度，可以寻找背景水平与阳性、阴性群体分离度之间的合理平衡。

• 流式实验是否都需要使用 Fc 受体封闭剂？

不需要。对于含有 Fc 受体表达细胞的样本，Fc 受体封闭可能很有帮助，但是否需要使用取决于样本类型和染色设计。它无法解决所有类型的背景问题。

总结

降低流式细胞术中的高背景信号，关键是先确定问题来源，再采取针对性的优化措施。通过比较适当的对照、评估细胞活率、优化抗体浓度、必要时进行 Fc 受体封闭，以及检查洗涤、样本处理和仪器参数，可以更有针对性地改善阳性与阴性细胞群体的区分。

系统地排查问题，有助于避免在尚未明确原因时频繁更换抗体或同时调整多个实验条件。

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