诺奖得主最新Science：结合结构生物学与进化规律，AI设计的最小RNA引导核酸酶

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过去十余年，CRISPR 技术不断刷新人们对基因编辑的认知。从 Cas9 到 Cas12，再到近年来陆续发现的 Cas12f、Cas14 以及 TnpB 等更小型的 RNA 引导核酸酶，研究人员始终在寻找一种理想的基因编辑工具：它足够小、足够精准，同时又能保持稳定高效的切割能力。

目前应用最广泛的递送方式之一——腺相关病毒（AAV）——能够携带的遗传信息十分有限。许多性能优异的核酸酶由于体积过大，难以与向导 RNA、调控元件等共同装入同一个载体，这也成为限制基因治疗发展的重要因素之一。

过去，解决这一问题的方法主要依赖不断发现新的天然蛋白。研究人员在不同微生物中筛选新的 CRISPR 系统，希望找到更小、更容易递送的新成员。但这种方式很大程度上仍然依赖自然界已经存在的答案。

2026 年 7 月 16 日，诺奖得主Jennifer Doudna团队提出了一种全新的设计思路——Structure- and Evolution-guided Design（结构与进化引导设计）。他们结合蛋白质进化规律和三维结构信息，对 RNA 引导核酸酶进行系统性重构，最终设计出一系列体积更小、仍保持编辑能力的最小核酸酶。

相关研究内容以「Structure and evolution-guided design of minimal RNA-guided nucleases」为题，发表在《Science》。

论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aed6123

为蛋白做一次减法

CRISPR 技术的发展，很长一段时间都遵循着同一种模式。

自然界发现一种新的 RNA 引导核酸酶，研究人员解析它的工作机制，再尝试将它应用于基因编辑。Cas9、Cas12 乃至近年来广受关注的 TnpB，都遵循着这样的发展路线。这种策略取得了巨大成功，却也存在天然局限。

自然界留下来的蛋白，是长期进化后的结果，并不一定完全符合人类应用需求。有些蛋白切割效率很高，却过于庞大；有些蛋白虽然体积很小，却难以保持稳定活性。如果始终依赖自然界不断「提供」新的工具，人们能够选择的空间终究有限。

论文提出的 Structure- and Evolution-guided Design，建立在「如果已经理解了这些核酸酶为什么能够工作，是否可以直接依据这些规律，主动设计出新的工具」的想法之上，研究目标不再是寻找新的蛋白，而是寻找蛋白真正不可替代的部分，再围绕这些核心结构重新构建整个系统。

图 1：结合 ESM 反向折叠（ESM-IF1）模型的 RNA 引导核酸酶 TnpB 设计策略。

研究采用 ESM-IF1 逆折叠模型作为基础骨架生成工具，针对纯逆折叠无法精准保留核酸结合功能位点的问题，开发了基于进化信息的残基固定策略，在保留核心功能的前提下最大化序列多样性。

但仅靠序列还不够。研究团队在对大量 TnpB、IscB 和 Cas 相关序列进行比对后发现，真正高度保守的往往只是少数几个关键位点，例如负责 RNA 识别和催化的核心残基，而其余区域则在不同家族中呈现明显的长度差异和序列漂移。

随后，团队将 TnpB 拆分为 DNA 识别的 REC 叶、催化 + RNA 结合的 NUC 叶独立设计，再两两组合测试，适配两个结构域不同的突变容忍度。通过调整约束阈值可精准控制序列与野生型的分化程度，最终生成序列与天然 TnpB 处于独立进化分支，一致性仅 50%-60%。

图 2：基于位置保守性和偶联强度阈值筛选人工智能生成的 TnpB 变体的富集情况。

按图构建

完成进化分析后，研究团队进一步开始了对 1980 种 REC-NUC 组合进行高通量功能验证。

在这些设计中，24% 的设计（466 种）具有可检测的核酸酶活性，其中 8% 的变体活性超过野生型 ISDra2 TnpB；双约束策略比单一保守性约束的活性变体数量显著提升。

图 3：AI 生成的 TnpB 在 HEK293T 细胞中的基因组编辑。

借助冷冻电镜解析结果以及结构预测模型，研究人员逐步建立起这些功能区域之间的对应关系，再依据前一步得到的进化约束，对不同模块进行重新组合与精简，而不是简单删除序列。

AI 生成的残基在 RNA/DNA 界面形成了全新的静电与氢键网络，在不同构象下均能稳定核酸复合物；新引入的突变与进化保留的核心功能位点互补，共同维持结合活性。

团队还解析到野生型 TnpB 中从未观测到的 TAM 结合中间构象，该瞬时态在 AI 设计变体中被稳定；由 AI 生成的螺旋区段完整保留了天然 TnpB 的螺旋弯折构象运动，而这一动态变化是异源双链形成、酶活激活的核心前提，证明逆折叠设计未破坏蛋白的功能必需构象转换。

图 4：AI 生成的变体的冷冻电镜结构揭示了新的 RNA-DNA 界面残基和保守的构象运动。

可设计空间的拓展

过去，CRISPR 领域的重要突破往往来自自然界的新发现。科学家不断寻找新的微生物，希望找到体积更小、性能更好的天然核酸酶，再围绕这些天然蛋白开展后续优化。

而 Structure- and Evolution-guided Design 提出了另一种可能。研究人员通过分析长期进化过程中哪些结构始终被保留、哪些区域可以不断演化，再结合蛋白质三维结构理解各个功能模块之间的关系，开始主动设计新的 RNA 引导核酸酶。

这是首次人工设计出具备全新核酸接触位点、高活性的非天然 TnpB 核酸酶，为后续开发更小、更精准、活性更优的编辑工具提供了新路径。