Cell Metabolism (IF=37)｜破解肥胖相关“瘦素抵抗”：FGF21联合瘦素，通过肝脏LEPRb恢复改善MASLD与糖脂代谢紊乱！(徐爱民-香港大学)

2026年7月16日，香港大学徐爱民团队，联合中南大学湘雅二医院、广州实验室、中山大学、广州医科大学附属第五医院、广州中医药大学等单位，在Cell Metabolism（中科院1区，TOP期刊，IF=37.0）发表题为 “FGF21 synergizes with leptin to counteract obesity-related metabolic comorbidities by reversing hepatic leptin resistance” 的研究论文。该文由 Qing Shen、Hailan Zou、Leigang Jin 等共同完成，徐爱民为通讯作者。该文于2025年12月15日投稿，2026年4月22日修回，2026年6月23日接收。

肥胖诱导的瘦素抵抗是肥胖及其相关代谢共病临床干预和药物开发中的重要难题。该研究发现，成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）可与瘦素（leptin）产生协同作用，通过增强肝细胞对瘦素的敏感性，改善肥胖相关代谢共病。其核心机制在于：FGF21作用于脂肪细胞，促进脂联素（adiponectin，APN）分泌；脂联素进一步通过磷酸化并激活信号转导和转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1），诱导肝细胞中功能性瘦素受体b（leptin receptor b，LEPRb/Leprb）表达，从而逆转肥胖相关外周瘦素抵抗。

研究进一步构建了一种长效FGF21/瘦素双激动剂 FGF21-Fc-leptin。与单独使用FGF21或瘦素相比，该双激动剂在小鼠中更有效地抵抗饮食诱导的体重增加、胰岛素抵抗、高血糖、血脂异常和代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD），且不影响摄食量。更具转化意义的是，在人原代肝细胞和人肝类器官中，脂联素而非FGF21本身，可逆转棕榈酸/油酸诱导的LEPRb下调，恢复瘦素抑制糖异生和肝脂肪变性的作用。

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【摘 要】

瘦素抵抗限制了瘦素在肥胖相关代谢共病治疗中的潜力。本研究表明，成纤维细胞生长因子21（FGF21）可通过逆转肥胖诱导的外周瘦素抵抗，在代谢调控中与瘦素产生协同作用。FGF21作用于脂肪细胞，促进脂联素分泌；脂联素随后通过磷酸化并激活肝细胞中的信号转导和转录激活因子1（STAT1），诱导瘦素受体表达。

腹腔注射一种长效FGF21/瘦素双激动剂，相较于FGF21或瘦素单激动剂，可在不影响摄食量的情况下，对饮食诱导的体重增加、胰岛素抵抗、高血糖、血脂异常和代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）产生更强的药理保护作用。在人原代肝细胞和人肝类器官中，脂联素而非FGF21可抵消棕榈酸/油酸诱导的瘦素受体b下调，从而恢复瘦素抑制糖异生和肝脂肪变性的作用。

因此，通过FGF21与瘦素在外周组织中的协同和互补作用，FGF21/瘦素双激动策略可能成为治疗肥胖相关多重代谢共病的一种潜在方法。

01

研究背景及科学问题

肽类激素通过整合器官间通讯，在维持全身代谢稳态中发挥核心作用。肽类激素产生异常或功能障碍，是一组相互关联的慢性代谢疾病发生发展的重要因素，包括肥胖、2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）、血脂异常以及代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）。基于肽类激素的药物治疗已成为慢性代谢疾病临床干预的重要方式。近年来，利用多种肽类激素之间的协同代谢调控作用开展联合治疗，相较于单药治疗，在肥胖相关共病中显示出更优治疗潜力。例如，胰高糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）/葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）双受体激动剂Tirzepatide已获批用于肥胖和T2DM治疗，而GLP-1/GIP/胰高糖素三受体激动剂也已进入III期临床试验。

瘦素是一种主要由脂肪组织产生的16 kDa肽类激素，可通过瘦素受体介导的信号网络调控能量平衡和代谢。瘦素的主要功能是向下丘脑神经元传递能量状态信号，从而调节摄食和能量消耗（energy expenditure，EE）。此外，瘦素还可在外周组织中发挥多种代谢作用，包括脂肪组织、肝脏和骨骼肌。在肝脏中，瘦素可抑制糖异生、增强脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO），并改善胰岛素敏感性。然而，瘦素的治疗应用受到肥胖状态下瘦素抵抗的限制。瘦素抵抗表现为高瘦素血症，以及中枢和外周组织中瘦素作用受损。瘦素受体下调、受体脱敏以及下游信号级联异常等机制，均被认为参与瘦素抵抗发生。反过来，瘦素抵抗也会促进肥胖、胰岛素抵抗、高血糖和MASLD的发生发展。目前尚无获批的针对瘦素抵抗的药物治疗手段。

FGF21是一种主要由肝脏产生的应激激素，也是能量稳态、糖代谢和脂代谢的重要调控因子。FGF21通过结合由经典成纤维细胞生长因子受体1c（fibroblast growth factor receptor 1c，FGFR1c）和必需共受体β-Klotho（KLB）组成的受体复合物发挥多效性功能。KLB表达高度局限于少数细胞类型，因此赋予FGF21作用的组织特异性。药理性给予FGF21已在多种动物模型中被反复证明可对肥胖相关共病产生多重治疗作用。同样，近期关于FGF21类似物的临床试验也显示，其在治疗MASLD、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）和血脂异常患者方面具有较好前景。然而，在多数临床研究中，FGF21类似物对体重下降和血糖控制的影响较弱，甚至没有明显作用，这提示基于FGF21的单药治疗可能不足以应对肥胖相关多重代谢共病。

鉴于FGF21和瘦素在代谢调控中既有重叠又有差异的作用，作者在肥胖小鼠中研究了这两种肽类激素之间的药理互作。结果显示，FGF21与瘦素联合给药在预防肥胖及其相关共病方面具有显著协同效应。因此，研究者开发了一种长效FGF21/瘦素双激动剂，并进一步在多种动物模型以及人肝类器官（human liver organoids，HLOs）中探索其药效学和作用机制。出乎意料的是，研究发现FGF21与瘦素之间的协同作用主要来自FGF21逆转肥胖诱导的外周瘦素抵抗的能力，即通过恢复肝细胞表面瘦素受体表达来增强瘦素作用，而这一过程并不影响摄食量。

02

重要发现及亮点

FGF21与瘦素协同改善小鼠肥胖相关代谢共病

为探索FGF21与瘦素之间的功能互作，研究者将重组人FGF21（hFGF21，100 nmol/kg）和重组人瘦素（hLEPTIN，100 nmol/kg）单独或联合给予饮食诱导肥胖小鼠，每日腹腔注射，连续14天。结果显示，hFGF21处理可使体重、脂肪量、血糖、胰岛素、C肽以及循环甘油三酯（triglycerides，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TC）水平出现轻度但显著下降，而单独给予瘦素对这些指标没有明显影响。值得注意的是，hFGF21与hLEPTIN联合处理在缓解肥胖、改善糖脂代谢谱方面的效果明显强于任一单独处理。间接量热分析同样显示，FGF21与瘦素联合给药在提高能量消耗和呼吸交换率（respiratory exchange ratio，RER）方面明显强于单独FGF21，而单独注射瘦素与溶剂对照相比无明显差异。同时，四组小鼠在自主活动、摄食量和瘦体重方面无明显差异，提示这种协同作用并非主要依赖食欲抑制。

与既往研究一致，hFGF21连续处理14天可部分但显著缓解肥胖诱导的MASLD，表现为肝脏重量和大小下降、肝脂肪变性改善、肝内脂质积累减少，以及血清肝损伤标志物丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）降低。更突出的是，hFGF21与hLEPTIN联合处理的小鼠几乎完全缓解肝脂肪变性和脂质积累，并使肝损伤标志物恢复正常，而单独瘦素处理并未改善这些指标。对附睾白色脂肪组织（epididymal white adipose tissue，eWAT）和皮下白色脂肪组织（subcutaneous white adipose tissue，sWAT）的整体形态和组织学分析也显示，hFGF21与hLEPTIN联合处理在降低两类脂肪垫湿重、脂肪量和脂肪细胞大小方面均明显强于单独hFGF21，而单独瘦素处理无显著作用。综上，这些发现提示，FGF21与瘦素之间存在协同作用，可在不依赖食欲调节的情况下缓解肥胖相关代谢并发症。

图1：FGF21与瘦素在小鼠中协同缓解肥胖及相关高血糖、高脂血症和脂肪肝。（A）研究设计示意图。8周龄雄性C57BL/6J小鼠接受高脂饮食（high-fat diet，HFD，45% kcal脂肪）喂养12周，随后每日腹腔注射重组人瘦素（hLEPTIN，100 nmol/kg体重）、人FGF21（hFGF21，100 nmol/kg体重）、hFGF21联合hLEPTIN（hF+hL），或生理盐水作为对照（vehicle），连续14天。随后处死小鼠并收集不同组织用于进一步分析。（B和C）蛋白处理前基线与处理14天后体重变化（B）和脂肪量变化（C）。（D）单次注射蛋白后不同时间点进食状态下血糖水平的动态变化。（E–H）血清胰岛素（E）、C肽（F）、甘油三酯（TG，G）和总胆固醇（TC，H）水平。（I–N）在蛋白处理第12至13天，通过间接量热法在连续48小时明暗周期内测量总能量消耗（EE，I）、呼吸交换率（RER，K）和自主活动（M）。明期和暗期平均EE（J）、RER（L）和自主活动（N）如图所示。（O和P）肝脏湿重（O）以及按肝组织总蛋白含量归一化后的肝内甘油三酯和胆固醇含量（P）。（Q）肝脏整体外观代表性图像（上排，比例尺5 mm）、肝切片H&E染色（中排，比例尺50 μm）和油红O（oil red O，ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（R和S）通过生化检测测定血清AST（R）和ALT（S）活性。（T）附睾白色脂肪组织和皮下白色脂肪组织（eWAT和sWAT）整体外观代表性图像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）及相应H&E切片（第二、第四排，比例尺50 μm）。（U–X）eWAT湿重（U）和脂肪细胞大小（V），以及sWAT湿重（W）和脂肪细胞大小（X）。所有柱状图中，黑点表示vehicle组，蓝色三角形表示hLEPTIN组，红色菱形表示hFGF21组，绿色倒三角形表示hF+hL组。数据以均值±标准误（mean ± SEM）表示。每组n=5–6只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；统计分析采用单因素方差分析（B、C、E–H、L、N–P、R、S和U–X）并进行Bonferroni事后检验。组间EE比较采用协方差分析（ANCOVA，J），以体重作为协变量。

长效FGF21/瘦素双激动剂在小鼠中显示更强治疗效应

天然FGF21和瘦素均为相对较小的多肽激素，循环半衰期较短，分别约为0.5–2小时和40分钟。为进一步探索二者的药理协同作用，研究者将人FGF21和瘦素分别融合至免疫球蛋白G片段结晶区（fragment crystallizable region，Fc）的N端和C端，构建了一种具有更优药代动力学特征的FGF21/瘦素双激动剂，命名为FGF21-Fc-leptin。SDS-PAGE和快速蛋白液相色谱证实，亲和纯化且去除内毒素的FGF21-Fc-leptin、FGF21-Fc、Fc-leptin和Fc具有较高纯度。体外活性实验显示，FGF21-Fc-leptin和FGF21-Fc在诱导过表达FGFR1/KLB受体复合物的HEK293细胞ERK磷酸化方面活性相当；同样，FGF21-Fc-leptin和Fc-leptin在诱导过表达功能性Leprb的HEK293细胞STAT3 Tyr705位点磷酸化方面效果相近。药代动力学分析显示，这些Fc融合蛋白在C57BL/6J小鼠循环中的半衰期约为20小时。

随后，研究者在饮食诱导肥胖小鼠中评价这些长效Fc融合蛋白的治疗效果：每2天腹腔注射一次，剂量为100 nmol/kg，持续2周。结果显示，FGF21-Fc-leptin在降低体重和脂肪量方面明显强于FGF21-Fc，并伴随更高的能量消耗和RER。四组小鼠在自主活动、瘦体重和摄食量方面无明显差异。与FGF21和瘦素联合给药短暂降糖作用不同，FGF21-Fc-leptin的强效降糖作用可在14天治疗期间持续存在，并伴随循环胰岛素和C肽明显下降，提示胰岛素敏感性改善。FGF21-Fc降低高血糖和高胰岛素血症的作用明显弱于FGF21-Fc-leptin。同样，与FGF21-Fc相比，FGF21-Fc-leptin处理小鼠血清甘油三酯和胆固醇降低幅度更大。

为进一步评价长效FGF21和瘦素单激动剂及双激动剂对糖代谢的影响，研究者进行了葡萄糖耐量试验（glucose tolerance test，GTT）、丙酮酸耐量试验（pyruvate tolerance test，PTT）和胰岛素耐量试验（insulin tolerance test，ITT），并检测胰岛素诱导的靶组织蛋白激酶B（AKT）激活。与Fc处理的饮食诱导肥胖（diet-induced obesity，DIO）小鼠相比，FGF21-Fc-leptin处理的小鼠在腹腔葡萄糖负荷后血糖波动明显改善，丙酮酸诱导的糖异生显著降低，胰岛素诱导的血糖下降幅度更大。FGF21-Fc也可改善葡萄糖不耐受、糖异生和胰岛素抵抗，但改善幅度明显小于FGF21-Fc-leptin。相比之下，Fc-leptin处理组与Fc对照组在GTT、PTT和ITT方面没有差异。

在组织和分子层面，FGF21-Fc-leptin比FGF21-Fc更有效地改善肥胖诱导的MASLD，表现为肝脏大小和重量恢复正常，肝脂肪变性、脂质积累和肝损伤标志物显著降低。FGF21-Fc-leptin降低eWAT和sWAT脂肪量及脂肪细胞大小的药理作用也明显强于FGF21-Fc。Fc-leptin对肥胖相关糖脂代谢紊乱、胰岛素水平、MASLD、脂肪细胞大小或脂肪量均无明显影响，提示FGF21-Fc-leptin的强效治疗作用来源于这一双激素激动剂的协同效应。

图2：长效FGF21/瘦素双激动剂在小鼠肥胖相关共病中具有强效治疗作用。（A）实验设计示意图。8周龄C57BL/6J小鼠接受HFD喂养12周，随后分别每2天腹腔注射一次FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）、Fc-leptin、FGF21-Fc和Fc，持续2周，剂量均为100 nmol/kg。（B和C）治疗前基线与治疗14天后体重变化（B）和脂肪量变化（C）。（D）进食状态下血糖水平在每次注射前连续监测14天。（E–G）在第12–13天，通过间接量热法在48小时明暗周期内测量总能量消耗（EE，E）、呼吸交换率（RER，F）和自主活动（G）。明期和暗期平均EE、RER和活动量如图所示。（H–J）治疗14天后测定血清胰岛素（H）、C肽（I）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC，J）水平。（K–P）在不同批次小鼠中，于蛋白治疗14天后进行葡萄糖耐量试验（GTT，K）、胰岛素耐量试验（ITT，M）和丙酮酸耐量试验（PTT，O）。GTT和PTT前禁食16小时，ITT前禁食6小时。相应曲线下面积（area under the curve，AUC）分别显示于（L）、（N）和（P）。（Q）肝脏整体外观代表性图像（上排，比例尺5 mm）、肝切片H&E染色（中排，比例尺50 μm）和油红O（ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（R和S）肝脏湿重（R）以及按肝蛋白含量归一化后的肝脏甘油三酯和胆固醇含量（S）。（T）血清AST和ALT活性。（U和V）eWAT湿重（U）和脂肪细胞大小（V）。（W）eWAT和sWAT整体外观代表性图像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）以及H&E染色的eWAT和sWAT切片（第二、第四排，比例尺50 μm）。（X和Y）sWAT湿重（X）和脂肪细胞大小（Y）。所有柱状图中，黑点表示Fc组，蓝色三角形表示Fc-leptin组，红色菱形表示FGF21-Fc组，绿色倒三角形表示L-Fc-F组。数据以均值±SEM表示。每组n=5–6只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01；统计分析采用单因素方差分析（B、C、F、G、H–J、L、N、P、R–V、X和Y）和双因素方差分析（D、K、M和O），并进行Bonferroni事后检验。组间EE比较采用ANCOVA（E），以体重作为协变量。

FGF21-Fc-leptin在GAN饮食诱导MASH和肝纤维化中优于FGF21-Fc

鉴于FGF21-Fc-leptin在DIO小鼠MASLD缓解中具有显著作用，研究者进一步在Gubra-Amylin NASH（GAN）饮食诱导的MASH小鼠模型中评价Fc标记的FGF21/瘦素单激动剂和双激动剂的药理作用。该模型表现为更严重的肝损伤、脂肪性肝炎和肝纤维化。与DIO小鼠结果一致，FGF21-Fc-leptin在降低GAN诱导的肝重增加、肝内脂质积累和肝损伤酶水平方面明显优于FGF21-Fc单药治疗。ORO和H&E染色显示，与FGF21-Fc相比，FGF21-Fc-leptin可更大程度改善MASH组织学特征和复合NAFLD活动度评分（NAFLD activity score，NAS）。免疫组化分析显示，FGF21-Fc-leptin处理小鼠肝脏中F4/80阳性巨噬细胞减少幅度也明显大于FGF21-Fc处理。Masson三色染色和天狼星红染色进一步提示，FGF21-Fc-leptin减轻肝纤维化的作用更强。与组织学变化一致，实时PCR分析显示，FGF21-Fc-leptin处理小鼠肝组织中促炎基因Mcp1、Tnfα、Il1b以及纤维化相关基因Col1a1、Col3a1、Acta2下调幅度更大。相比之下，Fc-leptin单药对GAN饮食小鼠的肝重、脂质积累、循环肝损伤标志物、MASH和纤维化组织学特征，以及促炎和纤维化相关基因表达均无明显影响。总体而言，这些结果进一步支持FGF21与瘦素在对抗MASH和肝纤维化中的协同作用。

FGF21通过上调肝细胞瘦素受体增强瘦素作用，而非作用于大脑

肥胖与外周和中枢瘦素抵抗均相关，其中部分原因是瘦素受体表达降低。研究者重新分析小鼠肝细胞单细胞RNA转录组数据后发现，与瘦小对照相比，饮食诱导肥胖小鼠肝脏瘦素受体（Lepr）表达显著降低。Lepr基因可通过可变剪接产生多种异构体，包括能够完整传递信号的长异构体Leprb、短异构体Lepra和Leprc，以及可溶性异构体Lepre。免疫印迹分析同样显示，DIO小鼠下丘脑和肝脏中Leprb蛋白表达降低。进一步细胞分离分析显示，DIO小鼠Leprb表达降低主要发生在肝细胞，而不是非实质细胞（non-parenchymal cells，NPCs）。由于既往研究曾发现FGF21处理肥胖小鼠后，肝脏中瘦素受体mRNA是显著上调基因之一，因此作者推测，FGF21与瘦素在肥胖小鼠中的协同效应可能来自FGF21改善瘦素抵抗的能力。

研究随后评估FGF21对多个主要瘦素靶组织中瘦素受体表达的慢性影响。与Fc对照组相比，FGF21-Fc处理显著增加肥胖小鼠肝脏中Leprb及其截短异构体Lepra、Leprc和Lepre表达，但在下丘脑、脂肪组织和腓肠肌中无此作用。进一步细胞分离分析显示，FGF21诱导的Leprb表达主要发生于肝细胞，而非NPCs。

天然形式的FGF21和瘦素均为小分子蛋白，可穿过血脑屏障进入大脑并调节能量稳态和代谢。为探索这些腹腔注射的Fc融合蛋白是否也能进入大脑，研究者在给药2小时后检测血清和脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中的人FGF21和人瘦素水平。结果显示，Fc-leptin和FGF21-Fc-leptin处理后，人瘦素在血清中含量丰富，但在CSF中几乎检测不到；同样，FGF21-Fc和FGF21-Fc-leptin处理后，人FGF21在血清中含量丰富，但在CSF中也几乎不可检测。此外，处理0.5小时后，FGF21-Fc-leptin和Fc-leptin可诱导瘦小小鼠肝脏中STAT3 Tyr705位点磷酸化，但不能诱导下丘脑STAT3磷酸化。这提示FGF21-Fc-leptin的药理活性主要由外周作用而非中枢作用介导。

图3：长期给予FGF21选择性增加肥胖小鼠肝细胞中的瘦素受体表达。（A）（B）–（J）实验设计示意图。8周龄C57BL/6J小鼠接受HFD喂养12周，随后用FGF21-Fc或Fc处理（100 nmol/kg，腹腔注射，每2天一次，持续2周）。收集下丘脑、肝脏和eWAT用于评估Leprb表达，并分离肝细胞（hepatocytes，HEPs）和非实质细胞（NPCs）进行细胞类型特异性分析。（B和C）实时PCR分析肝脏中瘦素受体异构体（Lepra、Leprb、Leprc和Lepre）的相对mRNA表达（B），以及下丘脑（Hypo）、eWAT和腓肠肌（gastrocnemius，Gas）中Leprb表达（C），并用β-actin归一化。Fc组数值设为1。（D和E）不同组织中LEPRb蛋白代表性免疫印迹图（D）及密度定量（E）。相对比较时，Fc组数值设为1。印迹膜经剥离后用指定抗体重新孵育。（F–H）Albumin mRNA表达（肝细胞特异性标志物，F）和F4/80 mRNA表达（巨噬细胞特异性标志物，G）用于确认HEPs和NPC组分分离成功。通过实时PCR测定HEPs和NPCs中Leprb mRNA表达（H）。（I和J）HEPs和NPCs中LEPRb蛋白表达水平的代表性免疫印迹图（I）及密度定量（J）。印迹膜经剥离后用指定抗体重新孵育。（K）（L）–（O）急性实验示意图。8周龄C57BL/6J小鼠单次腹腔注射FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）、Fc-leptin、FGF21-Fc或Fc（100 nmol/kg）。注射后120分钟收集血清和脑脊液（CSF）测定人瘦素和人FGF21；注射后30分钟收集肝脏和下丘脑，通过免疫印迹检测磷酸化STAT3（pSTAT3）。（L和M）使用ELISA试剂盒检测血清和CSF中人瘦素（L）和人FGF21（M）水平。（N和O）肝脏和下丘脑中pSTAT3（Tyr705）的代表性免疫印迹图（N）及定量（O）。数据以相对于Fc处理小鼠的倍数变化表示。印迹膜经剥离后用指定抗体重新孵育。数据以均值±SEM表示。每组n=5–6。**p < 0.01，***p < 0.001；统计分析采用双尾Student t检验（B、C、E–H和J）以及单因素方差分析（L、M和O），并进行Bonferroni事后检验。

肝细胞特异性恢复功能性瘦素受体可恢复FGF21-Fc-leptin在db/db小鼠中的治疗效应

前述结果提示，FGF21/瘦素双激动剂的强效治疗作用可能来自FGF21逆转肝细胞中肥胖诱导的瘦素抵抗。为进一步验证这一发现，研究者比较了FGF21-Fc-leptin在瘦素受体缺陷db/db小鼠中的药理作用，并观察在肝细胞中特异性恢复主要功能性瘦素受体Leprb后是否能恢复药效。研究者将小鼠Leprb克隆至由肝细胞特异性甲状腺素结合球蛋白（thyroxine-binding globulin，TBG）启动子驱动的慢病毒载体中，简称TBG-Leprb。随后，将TBG-Leprb或仅表达荧光素酶对照（TBG-luci）的慢病毒以1 × 10⁹ pfu/只剂量静脉注射至db/db小鼠，2周后再腹腔给予FGF21-Fc-leptin或Fc，持续14天。生物发光成像显示，荧光素酶主要在肝脏区域表达而非其他组织；Western blot进一步证实，TBG-Leprb注射小鼠肝细胞中表达FLAG标记的Leprb蛋白。

与TBG-luci对照小鼠相比，肝细胞特异性表达Leprb的db/db小鼠出现轻度但显著的体重、脂肪量、血糖、血清胰岛素、C肽、TC、TG和肝损伤标志物下降，并伴随肝脂肪变性缓解，以及eWAT和sWAT重量、脂肪细胞大小降低。这些由TBG-Leprb带来的改善伴随能量消耗增加，但摄食量和自主活动无明显变化。上述结果提示，仅恢复肝细胞中的功能性Leprb，即可部分改善db/db小鼠的肥胖相关代谢并发症。在慢病毒介导肝细胞特异性mLeprb表达的db/db小鼠中，FGF21-Fc-leptin注射表现出强效药理活性，可改善肥胖、高血糖、高胰岛素血症、高脂血症和MASLD，并降低肝损伤标志物、增加能量消耗。相反，在TBG-luci对照db/db小鼠中，FGF21-Fc-leptin的药理作用显著较弱。这说明，肝细胞中特异性恢复功能性Leprb足以使db/db小鼠重新对FGF21/瘦素双激动剂敏感。

图4：在db/db小鼠肝细胞中重建功能性瘦素受体（Leprb）可恢复FGF21/瘦素双激动剂的治疗效应。（A）实验设计示意图。8周龄雄性db/db小鼠静脉注射编码TBG驱动Leprb（TBG-Leprb）或荧光素酶对照（TBG-luci）的慢病毒，剂量为1 × 10⁹ pfu/只，随后接受FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）或Fc处理（100 nmol/kg，腹腔注射，每2天一次，持续2周）。（B）TBG-Leprb或TBG-luci注射2周后，分离肝细胞中C端FLAG标记LEPRb的代表性免疫印迹图。印迹膜经剥离后用指定抗体重新孵育。（C）慢病毒注射2周及随后蛋白处理2周期间体重动态变化。（D）L-Fc-F或Fc处理2周前后脂肪量相对变化。（E和F）单次注射后不同时间点测定进食状态下血糖水平（E），或在每次注射前连续29天监测血糖（F）。（G–I）小鼠处死后收集样本，测定血清胰岛素（G）、C肽（H）、总TC和TG（I）水平。（J）肝脏整体外观代表性图像（上排，比例尺5 mm）、H&E染色（中排，比例尺50 μm）和肝切片油红O（ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（K）血清AST和ALT水平。（L和M）肝脏湿重（L）以及按肝蛋白含量归一化后的肝脏甘油三酯和胆固醇含量（M）。（N）eWAT和sWAT整体外观代表性图像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）和H&E切片（第二、第四排，比例尺50 μm）。（O–R）eWAT湿重（O）和脂肪细胞大小（P），以及sWAT湿重（Q）和脂肪细胞大小（R）。（S–X）在蛋白处理第12至13天，通过间接量热法在连续48小时明暗周期内测定总能量消耗（EE，S）、呼吸交换率（RER，U）和自主活动（W）。明期和暗期平均EE（T）、RER（V）和活动量（X）如图所示。所有柱状图中，黑点、蓝色三角形、红色菱形和绿色倒三角形分别代表TBG-luci+Fc、TBG-luci+L-Fc-F、TBG-Leprb+Fc和TBG-Leprb+L-Fc-F。数据以均值±SEM表示。每组n=5–7只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；统计分析采用单因素方差分析（D、G–I、K–M、O–R、V和X）和双因素方差分析（C、E和F），并进行Bonferroni事后检验。组间EE比较采用ANCOVA（T），以体重作为协变量。

肝细胞特异性敲除Lepr阻断FGF21与瘦素的协同效应

为进一步阐明肝脏瘦素受体在FGF21与瘦素协同作用中的作用，研究者通过向Leprflox小鼠静脉注射由肝细胞特异性TBG启动子驱动的Cre重组酶AAV，构建肝细胞特异性Lepr敲除小鼠（Lepr-HKO）。Western blot分析证实，Lepr-HKO小鼠肝细胞中Lepr被选择性消融，而NPCs中未出现同样改变。

如预期，HFD喂养的Leprflox野生型（WT）小鼠接受FGF21-Fc-leptin治疗2周后，与Fc处理小鼠相比，体重、脂肪量、血糖、血清胰岛素、C肽、TC和TG显著下降，肝损伤和脂肪变性改善，eWAT和sWAT重量及脂肪细胞大小降低，EE和RER升高。然而，在HFD喂养的Lepr-HKO小鼠中，FGF21-Fc-leptin缓解HFD诱导脂肪堆积、高血糖、高胰岛素血症、低脂联素血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和MASLD的这些药理益处均明显减弱。FGF21-Fc-leptin或Fc处理后，Lepr-HKO小鼠与Leprflox小鼠的摄食量、瘦体重和自主活动相当。综上，这些发现支持肝脏Lepr在FGF21/瘦素双激动剂对抗肥胖相关代谢并发症药理作用中具有必要作用。

图5：肝细胞特异性消融瘦素受体可取消FGF21/瘦素双激动剂在肥胖小鼠中的治疗作用。（A）研究设计示意图。8周龄雄性Leprflox小鼠接受HFD喂养12周，随后静脉注射腺相关病毒8型，表达由TBG启动子驱动的Cre重组酶（AAV8-TBG-Cre），以生成肝细胞（HEP）特异性Lepr敲除小鼠（Lepr-HKO）；或注射表达由TBG驱动荧光素酶的AAV8作为对照（WT），剂量为5 × 10¹¹ pfu/只。2周后，小鼠接受FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）或Fc处理（100 nmol/kg，腹腔注射，每2天一次，持续2周）。（B和C）AAV注射2周后，HEPs和非实质细胞（NPCs）中LEPRb蛋白表达：代表性免疫印迹图（B）和密度定量（C），以相对于WT的倍数变化表示。印迹膜经剥离后用指定抗体重新孵育。（D和E）治疗14天期间体重变化（D）和脂肪量变化（E）。（F和G）单次注射后不同时间点测定进食状态下血糖水平（F），并在每次注射前连续14天监测血糖（G）。（H–J）小鼠处死后测定血清胰岛素（H）、C肽（I）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG，J）。（K和L）肝脏湿重（K）以及按蛋白含量归一化后的肝内甘油三酯和胆固醇（L）。（M和N）血清AST（M）和ALT（N）活性。（O）肝脏整体外观代表性图像（上排，比例尺5 mm）、H&E染色（中排，比例尺50 μm）和肝切片油红O（ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（P）eWAT和sWAT整体外观代表性图像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）及相应H&E切片（第二、第四排，50 μm）。（Q–T）eWAT湿重（Q）和脂肪细胞大小（R），以及sWAT湿重（S）和脂肪细胞大小（T）。（U–Z）在蛋白处理第12至13天，通过间接量热法在连续48小时明暗周期内测定总能量消耗（EE，U）、呼吸交换率（RER，W）和自主活动（Y）。明期和暗期平均EE（V）、RER（X）和活动量（Z）如图所示。除（C）外，所有柱状图中黑点、蓝色三角形、红色菱形和绿色倒三角形分别代表WT+Fc、WT+L-Fc-F、Lepr-HKO+Fc和Lepr-HKO+L-Fc-F。数据以均值±SEM表示。每组n=5–7只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；统计分析采用双尾Student t检验（C）、单因素方差分析（E、H–N、Q–T、X和Z）以及双因素方差分析（F和G），并进行Bonferroni事后检验。组间EE比较采用ANCOVA（V），以体重作为协变量。

FGF21通过脂肪细胞来源的脂联素诱导肝脏Leprb表达

FGF21通过结合由FGFR1和β-Klotho组成的受体复合物发挥作用。然而，肝细胞是否为FGF21的直接靶细胞仍存在争议。研究者重新分析GEO数据库中健康和MASLD小鼠肝脏肝细胞及NPCs的单细胞RNA测序数据后发现，只有肝细胞同时表达KLB和FGFR1，但KLB和FGFR1双阳性细胞仅占总肝细胞群的0.17%。值得注意的是，脂肪细胞分泌的脂联素已被证明是介导FGF21多种代谢作用的下游效应因子。因此，研究者进一步探讨FGF21是直接作用于肝细胞，还是通过脂联素间接诱导Lepr表达。

在体外，研究者用油酸（oleic acid，OA，500 μM）和棕榈酸（palmitic acid，PA，250 μM）混合物处理小鼠原代肝细胞，以模拟肥胖诱导的肝脂肪变性。PA/OA处理显著降低Leprb mRNA和蛋白表达。脂质负载肝细胞经重组小鼠脂联素处理后，Leprb表达明显升高，而重组小鼠FGF21没有这一作用。同样，脂联素而非FGF21可显著增强瘦素抑制PA/OA诱导的两个关键糖异生基因PEPCK1和G6Pase表达的作用，并降低肝糖输出。此外，脂联素处理还明显增强瘦素促进FAO相关基因Cpt1ɑ、Cpt2和Pparɑ表达以及氧消耗的活性。PA/OA或蛋白处理均未影响小鼠原代肝细胞活力。总体而言，这些发现提示，FGF21在脂质负载肝细胞中增强瘦素敏感性的作用，可能由脂肪细胞来源的脂联素介导。

脂联素通过激活转录因子STAT1诱导肝脏Leprb表达

为研究脂联素如何诱导肝细胞Leprb表达，研究者进行了计算机预测分析，在hTFtarget、ENCODE、GTRD、FIMO_JASPAR和KnockTF五个数据库中预测参与Leprb基因调控的转录因子。交集分析确定了三个转录因子STAT1、JUND和SP1，这些因子可能结合Leprb基因启动子区域。染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）分析显示，脂联素处理可显著诱导STAT1结合其预测DNA结合位点，但对JUND或SP1与各自Leprb启动子DNA基序的结合无明显影响。序列比对分析显示，Leprb基因启动子中的STAT1结合基序在多种哺乳动物物种中高度保守，进一步支持STAT1对Leprb基因表达的调控作用。

既往研究提示，脂联素可在体外诱导OCCM-30细胞中STAT1磷酸化。因此，研究者进一步考察脂联素是否通过STAT1磷酸化诱导肝脏Leprb基因表达。小鼠原代肝细胞接受脂联素处理30分钟后，STAT1 Tyr701位点磷酸化显著增强。进一步使用STAT1特异性抑制剂氟达拉滨（fludarabine，FLU）进行药理抑制后，脂联素促进STAT1结合Leprb启动子和诱导肝细胞Leprb蛋白表达的作用大幅消失。

图6：脂联素通过STAT1介导的瘦素受体上调，使瘦素对肝细胞糖脂代谢的作用重新敏化。（A）实验设计示意图。从6周龄雄性C57BL/6J小鼠分离原代肝细胞，先用250 μM棕榈酸和500 μM油酸（PA/OA）孵育24小时，随后在有或无10 μg/mL高分子量（high-molecular-weight，HMW）脂联素（APN）或100 ng/mL重组小鼠FGF21条件下处理20小时，再根据实验需要有或无100 ng/mL重组小鼠瘦素处理4小时（B–F）。（B）APN或FGF21处理20小时后，通过实时PCR测定Leprb mRNA表达。（C和D）原代肝细胞中LEPRb蛋白：代表性免疫印迹图（C）和密度定量（D）。（E）糖异生基因Pepck1、G6Pase以及脂肪酸氧化（FAO）相关基因Cpt1a、Cpt2和Pparɑ的相对mRNA水平。（F）瘦素处理4小时后，使用葡萄糖检测试剂盒测定肝糖输出。（G）使用FAO检测和氧消耗检测试剂盒测定FAO驱动的肝细胞O₂消耗（每3分钟一个点）。FCCP和依托莫昔（etomoxir）分别作为阳性和阴性对照。荧光信号每3分钟采集一次，激发/发射波长为380/650 nm。（H和I）从6周龄雄性C57BL/6J小鼠分离小鼠原代肝细胞，有或无10 μg/mL小鼠APN处理24小时，随后超声处理并分别使用抗STAT1、抗SP1和抗JUND抗体进行ChIP。（H）终点ChIP-PCR产物代表性凝胶图像；（I）三个转录因子与其顺式DNA元件结合的半定量结果，以输入DNA百分比表示：% of input = 2^(CTInput−CTi.p.)/稀释因子 × 100%。（J和K）有或无小鼠APN处理30分钟后，肝细胞用于免疫印迹分析磷酸化STAT1（Tyr701）。（J）代表性印迹图；（K）密度定量。印迹膜经剥离后用指定抗体重新孵育。（L和M）肝细胞接受APN（10 μg/mL）处理，并有或无STAT1抑制剂氟达拉滨（FLU，2 μg/mL）共同处理24小时，随后进行STAT1 ChIP。（L）代表性ChIP-PCR凝胶图。（M）柱状图表示输入DNA百分比：% of input = 2^(CTInput−CTi.p.)/稀释因子 × 100%。（N和O）STAT1抑制对APN诱导LEPRb蛋白的影响。APN ± FLU处理肝细胞24小时后检测LEPRb蛋白：（N）代表性免疫印迹图；（O）密度定量。印迹膜经剥离后用指定抗体重新孵育。数据以均值±SEM表示。每组n=5–6。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；统计分析采用双尾Student t检验（I和K）、单因素方差分析（B、D、E、F、M和O）以及双因素方差分析（G），并进行Bonferroni事后检验。

脂联素缺失消除FGF21与瘦素在肥胖小鼠中的协同作用

为进一步验证体内FGF21是否通过脂联素增强肝脏瘦素敏感性，研究者比较了FGF21-Fc-leptin在脂联素敲除（APN-KO）小鼠和WT同窝小鼠饮食诱导肥胖模型中的作用。结果显示，WT小鼠接受FGF21-Fc-leptin治疗14天后，肝细胞Leprb mRNA和蛋白表达显著升高，而这一作用在APN-KO小鼠中被取消。同样，FGF21-Fc-leptin处理WT小鼠后，体重、脂肪量、血糖水平，以及血清胆固醇、甘油三酯、胰岛素和C肽水平均明显下降，同时伴随EE和RER升高、肝脂肪变性减少、AST和ALT降低，以及eWAT和sWAT质量、重量和脂肪细胞大小下降。然而，在APN-KO小鼠中，FGF21-Fc-leptin缓解饮食诱导肥胖相关代谢共病的协同作用被显著削弱。此外，FGF21-Fc-leptin可在WT小鼠中显著抑制肥胖诱导的两个关键糖异生基因PEPCK1和G6Pase表达，并上调FAO相关基因Cpt1ɑ、Cpt2和Pparɑ表达，但在APN-KO小鼠中没有相同效果。WT和APN-KO小鼠在FGF21-Fc-leptin或Fc处理后的自主活动和摄食量相当。综合来看，这些结果提示，脂联素缺失会损害FGF21增加肝细胞瘦素受体的能力，从而取消FGF21与瘦素之间的协同作用。

脂联素改善脂质负载人肝细胞和人肝类器官中的瘦素敏感性与糖脂代谢

为探索动物模型发现的转化潜力，研究者进一步在人肝细胞中考察FGF21、脂联素和瘦素之间的功能互作。细胞先用OA（500 μM）和PA（250 μM）预孵育24小时诱导脂肪变性，随后用人脂联素或FGF21处理20小时，并在最后4小时有或无加入人瘦素。与小鼠肝细胞结果相似，脂联素而非FGF21显著逆转PA/OA诱导的Leprb基因表达下降。同样，脂联素而非FGF21显著增强瘦素抑制PA/OA诱导肝糖输出以及促进氧消耗的作用。这些脂联素诱导的变化，与共同刺激瘦素和脂联素时两个糖异生基因Pepck1和G6pase表达显著降低、FAO相关基因Cpt1ɑ、Cpt2和Pparɑ表达升高相一致。

为进一步验证FGF21与瘦素在MASLD中的药理协同作用，研究者构建了人肝类器官（HLOs）。具体而言，研究者将无足迹人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）来源的后前肠细胞在肝球培养基中分化12天，再在肝类器官培养基中成熟14天，并在成熟阶段加入250 μM PA和500 μM OA诱导脂肪变性。成熟阶段第8至14天，类器官接受重组人FGF21、人脂联素、人瘦素或人瘦素联合人脂联素刺激。结果显示，与BSA对照相比，PA/OA诱导HLOs中Leprb表达明显下降。脂联素或脂联素联合瘦素，而非FGF21或瘦素，可在很大程度上将PA/OA处理HLOs中的Leprb基因表达恢复至接近BSA对照水平。同样，脂联素和瘦素联合处理HLOs可更显著降低糖输出和两个糖异生基因表达，并更强地上调FAO相关基因。尼罗红染色和生化分析显示，PA/OA诱导的HLOs脂滴形成和甘油三酯积累几乎可被脂联素联合瘦素处理完全阻断，而单独脂联素仅产生轻度降低；相反，FGF21处理对PA/OA诱导的HLOs糖异生、脂滴形成或甘油三酯积累无影响。总体而言，这些数据进一步支持这样一种观点：FGF21与瘦素改善糖脂代谢和缓解MASLD的协同效应，是通过脂联素依赖性的肝细胞瘦素作用敏化实现的。

图7：APN抵消游离脂肪酸导致的瘦素脱敏，从而在人肝细胞和HLOs中抑制脂肪变性与糖异生。（A）（B）–（E）实验设计示意图。人肝细胞先用溶解于1% BSA中的棕榈酸（PA，250 μM）和油酸（OA，500 μM）（PA/OA）或仅1% BSA处理24小时，随后用重组人脂联素（APN，10 μg/mL）或人FGF21（100 ng/mL）处理20小时，或用PBS作为对照，再根据指定条件用重组人瘦素（100 ng/mL）刺激4小时。（B）不同处理条件下肝细胞LEPRb mRNA水平，表示为相对于未接受蛋白处理细胞的倍数变化。（C和D）不同处理条件下肝糖输出（C）以及两个关键糖异生基因PEPCK1和G6Pase的相对mRNA丰度（D）。（D和E）若干脂肪酸氧化（FAO）相关基因Cpt1a、Cpt2和Pparɑ的mRNA表达水平（D）。使用FAO和氧消耗检测试剂盒评估FAO依赖性O₂消耗（E），FCCP和依托莫昔分别作为阳性和阴性对照，信号每3分钟在380/650 nm记录一次。（F）HLOs实验流程示意图。在分化阶段，将无足迹人诱导多能干细胞（iPSC）细胞系在肝球培养基中培养12天，形成肝球（LivS）。在成熟阶段，LivS在肝类器官（LivO）培养基中培养14天，并用游离脂肪酸（PA/OA，500 μM油酸和250 μM棕榈酸）或1% BSA作为空白对照处理，最终形成脂肪肝类器官（fatty liver organoid，FLO）。在成熟阶段第8至14天，FLOs接受人瘦素（100 ng/mL）、人FGF21（100 ng/mL）、人APN（10 μg/mL）、人APN联合人瘦素（APN+leptin）以及PBS对照处理。（G和H）指定处理条件下FLOs中LEPRb mRNA（G）和肝糖输出（H）。（I）糖异生基因PEPCK1、G6Pase以及FAO相关基因Cpt1a、Cpt2和PPARα的mRNA水平，表示为相对于PBS处理FLOs的水平。（J）FLO中甘油三酯浓度。（K）FLO脂滴的尼罗红染色。明场图像显示类器官整体形态。脂滴和细胞核分别用尼罗红（红色）和DAPI（蓝色）染色/复染。比例尺50 μm。（L）不同处理条件下PA/OA诱导脂肪变性的半定量脂质评分。评分基于任意颜色标尺，范围从0（绿色，未接受PA/OA处理的对照类器官基础脂质水平）到1（红色，未接受蛋白处理的PA/OA处理类器官最大脂质积累）。每个柱代表一个单独类器官。（M）FLOs中各组平均脂质评分。数据以均值±SEM表示。每组n=4–7。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；统计分析采用单因素方差分析（B–D、G–J和M）以及双因素方差分析（E），并进行Bonferroni事后检验。

【贡献】★★★★★

本研究揭示了一种此前未被充分认识的外周组织层面FGF21与瘦素协同互作模式，可改善能量稳态和糖脂代谢。考虑到多项肥胖人群临床试验显示，基于FGF21类似物的单药治疗效果有限，尤其在减重和血糖控制方面较弱，本研究开发的长效FGF21/瘦素双激动剂FGF21-Fc-leptin，可能为增强FGF21类药物治疗肥胖相关多重代谢共病的疗效提供一种有前景的策略。

同时，作者也指出了研究局限：本研究主要在雄性小鼠中进行，尚未评估FGF21与瘦素互作的性别差异，以及FGF21/瘦素双激动剂治疗是否存在性别特异性反应；每组小鼠实验样本量相对较小；不同蛋白药物处理持续时间较短，其长期疗效和安全性仍需进一步研究；虽然研究使用了人原代肝细胞和人肝类器官来探索小鼠发现的临床转化可能性，但尚未提供药理性FGF21改善人类肥胖诱导肝脏瘦素抵抗的直接证据。

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