大卫贝克团队用AI构建可编程荧光标签，利用生成式蛋白实现高精度多目标荧光成像

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如果想同时观察一个细胞里的多个蛋白质，会遇到一个看似简单却始终困扰生物学家的问题。

传统荧光成像依赖不同颜色的荧光染料对目标进行标记。然而，随着需要同时观察的目标越来越多，有限的荧光颜色很快就会成为瓶颈。更麻烦的是，不同荧光蛋白之间往往存在光谱重叠，不仅降低图像质量，也限制了复杂生物过程的解析能力。

而近年来新兴的思路是设计能够专门识别这些染料的小型蛋白标签。但对于天然蛋白而言，很难同时满足稳定折叠、小体积、高亲和力这些需求；传统蛋白工程主要依赖天然模板不断改造，既耗时，也很难突破天然结构本身的限制。

大卫贝克团队于 2026 年 7 月 16 日发表了一项研究，在「De novo design of orthogonal far-red, orange, and green fluorophore-binding proteins for multiplexed imaging」中，团队提出了NovoTag技术路线。他们结合 AI 蛋白设计、结构预测和实验筛选，从零开始设计能够特异性结合不同荧光染料的新型蛋白标签，并进一步构建出一套适用于多目标荧光成像的蛋白—染料体系。

论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aeb0822

重新设计蛋白

过去，大多数荧光标签的发展都建立在天然蛋白基础之上。

研究人员通常会先找到一种能够与特定小分子结合的天然蛋白，再通过定点突变、定向进化等方法不断优化结合能力。这种策略已经取得了不少成功，但也存在明显局限：天然蛋白原本承担着各自的生物学功能，它们的结构并不是为了识别人工荧光染料而进化出来，因此能够优化的空间始终有限。

因此，研究团队选择了一条完全不同的技术路线。

团队借鉴了「伪环状结构」的思路：让蛋白质形成一个封闭的环状口袋，将染料包裹其中。这种结构在天然小分子结合蛋白中常见，但从未在「配体感知」的设计语境中被系统应用。他们希望直接设计一种全新的蛋白，让蛋白的空间结构从一开始就围绕目标荧光染料进行构建，而不是在天然蛋白基础上不断修补。

图 1：结合 Janelia 荧光染料蛋白的设计与表征。

技术上，团队使用了 Cα RFdiffusion——一种生成式深度学习模型——直接围绕每种染料的三维结构生成蛋白质骨架。这能让模型从起点就知道染料的位置和形状，在染料周围「生长」出合适的蛋白结构。随后用 LigandMPNN 为骨架赋予序列，并通过 Rosetta 计算结合能、AlphaFold2 验证序列-结构一致性，从数千个候选中筛选出高置信度设计，最终在酵母表面展示和流式分选中确认活性。

这些 Janelia Fluor 染料是人工合成的罗丹明衍生物，团队利用机器学习驱动的 de novo 蛋白设计，从零开始创造出了三种小型结合蛋白：NovoTag494、NovoTag596 和 NovoTag657，分别特异性地结合绿、橙、远红三种染料。

三种目标染料共享同一个罗丹明核心骨架，只是在边缘有细微的化学修饰差异。这种结构相似性对特异性提出了极高要求——结合蛋白必须像精密模具一样，识别出染料核心周围每一个取代基的微小差别。

图 2：利用 NovoTags 在活细胞和固定细胞中进行多重超分辨率荧光显微镜成像。

进入应用场景

对于蛋白设计而言，最大的挑战始终存在于计算预测与生物实验之间。一个在计算模型中看似完美的结合口袋，可能因为蛋白折叠不稳定、分子环境变化，或者细胞内部复杂条件影响，最终无法实现预期功能。

研究团队首先针对多种不同荧光染料设计候选蛋白标签，并通过实验筛选其中真正能够稳定表达、正确折叠并与目标分子结合的结构。结果显示，部分从头设计的蛋白能够实现高度特异性的染料识别，同时保持较小的蛋白尺寸和良好的稳定性。

此外，通过改变蛋白结合口袋的结构，不同 NovoTag 还能分别识别不同荧光染料。每一种标签都相当于一个独立的「分子接口」，能够与对应染料产生选择性结合，同时尽量避免与其他染料发生干扰。

图 3：基于荧光寿命的 NovoTags 多重成像显微镜技术。

如团队预期那般，AlphaFold 3的预测进一步证实，三种 NovoTag 与各自靶标染料形成的复合物获得了最高的置信度评分，它们对各自靶标染料的亲和力达到纳摩尔级别（Kd 分别为 19.1 nM、1.5 nM 和 2.0 nM），而对其他两种染料的特异性超过 1000 倍。

新一代的标记方式

NovoTag 展示的并不仅仅是一种新的荧光标签技术。它标志着蛋白质设计正在从「模仿自然」迈向「超越自然」——自然界从未进化出结合这些人工染料的蛋白，但计算工具让我们能够为任何小分子量身定制结合器。

当然，NovoTag 仍然面临进一步发展的挑战。例如，如何提高设计成功率、如何扩大可识别染料范围、如何让这些标签适应更加复杂的生物环境，都是未来需要解决的问题。据研究团队估算，若能结合先进的光谱解混技术和寿命区分，未来可能实现 30 种以上同时可分辨的探针。