联手唐本忠院士！内蒙古大学，最新JACS：全氟烷基阴离子策略构建阴离子-π⁺型NIR-II光诊疗剂，通过坏死性凋亡/铁死亡增强肿瘤免疫治疗

肿瘤免疫治疗虽能激活宿主免疫系统并建立长期免疫记忆，但实体瘤异质性和免疫抑制微环境仍限制其疗效。光动力治疗可通过ROS介导的免疫原性细胞死亡重塑肿瘤免疫微环境，NIR-II发光和AIE活性光敏剂因穿透深、抗π-π堆积而更具潜力；然而现有体系仍受大共轭骨架成本高、ROS生成与细胞摄取有限、主要经光热诱导凋亡而导致免疫沉默等问题制约。坏死性凋亡和铁死亡可释放免疫原性信号、增强抗肿瘤免疫，但能同时激活二者且具AIE活性的NIR-II光敏剂仍稀缺；阴离子-π⁺相互作用和氟原子带来的范德华作用、抑制非辐射衰减等优势尚未在阴离子调控层面充分用于此类光敏剂。

为此，内蒙古大学王建国教授、香港中文大学（深圳）唐本忠院士合作，提出全氟烷基阴离子策略：以单侧全氟烷基链的PFB和双侧全氟烷基链的BPFB替换A/HFA与TPQ/HFA中的HFA反离子，得到A/PFB、TPQ/PFB、A/BPFB和TPQ/BPFB。BPFB通过阴离子-π⁺和范德华相互作用更有效限制分子内运动，使A/BPFB NPs和TPQ/BPFB NPs荧光强度分别较HFA类似物提高50.8倍和4.2倍；TPQ/BPFB NPs兼具NIR-II发射、优异线粒体靶向、强ROS生成和抗光漂白能力，光照下同时激活坏死性凋亡与铁死亡，触发系统性免疫，并借BPFB赋予的亲脂性加深肿瘤穿透，实现95%的肿瘤抑制率，免疫记忆还显著减少肺转移。相关论文以“Perfluoroalkyl Anion Strategy to Construct Anion–π+ Type NIR-II Phototheranostic Agents for Enhanced Tumor Immunotherapy via Necroptosis/Ferroptosis”为题，发表在JACS上。

研究首先以A/HFA和TPQ/HFA为起点，用PFB和BPFB替换HFA并制备纳米颗粒，形成从HFA到PFB再到BPFB的阴离子演变序列（图1a）；随全氟烷基链由单侧变为双侧，体系朝增强荧光和ROS生成方向变化，并赋予NIR-II发射、线粒体靶向、I型ROS生成、坏死性凋亡/铁死亡诱导和抗转移等特征；在660 nm光照下，ROS参与GPX4相关铁死亡和RIPK1/RIPK3/MLKL相关坏死性凋亡，释放DAMPs并推动免疫激活，最终抑制原发肿瘤和肺转移（图1b）。

图1：（a）全氟烷基阴离子策略增强荧光强度和ROS产生性能。（b）坏死性凋亡和铁死亡激活强大免疫，抑制原发肿瘤和肺转移（由Figdraw创建）。

为在分子层面验证阴离子策略，研究测定了A系列和TPQ系列在PBS中的吸收/发射光谱，并用等温滴定量热和分子动力学模拟解析阴离子与π⁺核心的结合。引入PFB、尤其BPFB后，体系吸收红移、荧光显著增强（图2a-d）；BPFB与A/HFA强结合，与TPQ/HFA的解离常数低至3.41×10⁻⁶ M，结合过程自发（图2e-h）；模拟显示BPFB与π⁺核心及含硫芳环的范德华作用更强，离子对更紧密，MSD明显降低（图2i-l）。这表明全氟烷基阴离子尤其BPFB能与π⁺核心形成更紧密的离子对，通过阴离子-π⁺和范德华作用限制分子内运动、抑制非辐射耗散，从而增强荧光。

图2：（a）A/HFA、A/PFB和A/BPFB在PBS中的吸收光谱；（b）其光致发光（PL）光谱。（c）TPQ/HFA、TPQ/PFB和TPQ/TPQ/BPFB在PBS中的吸收光谱；（d）其PL光谱。25 °C下（e-f）PFB阴离子或（g-h）BPFB阴离子滴定TPQ/HFA的等温滴定量热数据。（i）100个BPFB阴离子与100个π⁺核心形成紧密结构的分子动力学模拟。（j）阴离子（HFA、PFB和BPFB）与π⁺核心之间随时间变化的范德华相互作用能。（k）阴离子（HFA、PFB和BPFB）与π⁺核心中含硫芳环之间随时间变化的范德华相互作用能。（l）均方位移（MSD）随时间的变化。

在纳米颗粒层面，研究比较了A系列和TPQ系列NPs的吸收/发射光谱、平均荧光强度、DCFH探针ROS生成和飞秒瞬态吸收。BPFB取代后NPs荧光显著增强（图3a-f），TPQ/BPFB NPs的ROS生成更快更强，仅4 min即达平台（图3g）；瞬态吸收显示聚集后激发态寿命延长、慢组分幅度增加、基态漂白恢复更慢（图3h、i）。这说明BPFB NPs的荧光和ROS生成能力同步提升，聚集可抑制非辐射衰减、促进ISC和三重态生成，从而提高ROS产生效率。

图3：（a）A/HFA NPs、A/PFB NPs和A/BPFB NPs（10 μM）在PBS中的吸收光谱；（b）其PL光谱。（c）TPQ/HFA NPs、TPQ/PFB NPs和TPQ/BPFB NPs（10 μM）在PBS中的吸收光谱；（d）其PL光谱。（e）A/HFA NPs、A/PFB NPs和A/BPFB NPs（20 μM）在PBS中的平均荧光强度。数据以均值±SD表示，每组n=3，p<0.001。（f）TPQ/HFA NPs、TPQ/PFB NPs和TPQ/BPFB NPs（20 μM）在PBS中的平均荧光强度。数据以均值±SD表示，每组n=3，p<0.01，**p<0.001。（g）在TPQ/HFA NPs、TPQ/PFB NPs和TPQ/BPFB NPs存在下，DCFH在660 nm激光照射（0.1 W cm⁻²）不同时间后PL强度的相对变化。（h）TPQ/BPFB在水中的飞秒瞬态吸收及激发态动力学分析。（i）TPQ/BPFB在583 nm处的光诱导吸收动力学。

在细胞层面，研究用MitoTracker Green共定位、连续激光照射、DCFH-DA染色、MTT和Calcein-AM/PI评价线粒体靶向、抗光漂白、胞内ROS与光毒性。A/BPFB NPs和TPQ/BPFB NPs与线粒体的Pearson相关系数超过0.84（图4a），而与溶酶体和脂滴的相关系数分别低于0.23和0.25；500 s连续照射后TPQ/BPFB NPs仍保留69%荧光，优于TPQ/HFA NPs的32%和TPQ/PFB NPs的43%（图4b、c）；TPQ/BPFB NPs在胞内产生最强ROS信号（图4d、e），TPQ/BPFB NPs在3 μM光照下使HeLa细胞存活率降至7.0%，暗毒性很小、存活率>95%（图4h），活/死染色亦显示光照后几乎全部为红色死细胞信号（图4i）。

图4：（a）A/BPFB NPs和TPQ/BPFB NPs与MitoTracker Green的共定位图像。比例尺=5 μm。（b）连续激光照射下A/HFA NPs、A/PFB NPs和A/BPFB NPs的信号变化。（c）连续激光照射下TPQ/HFA NPs、TPQ/PFB NPs和TPQ/BPFB NPs的信号变化。（d）A/HFA NPs、A/PFB NPs、A/BPFB NPs（4 μM）在HeLa细胞中使用DCFH-DA作为总ROS荧光指示剂的ROS生成。比例尺=20 μm。（e）TPQ/HFA NPs、TPQ/PFB NPs和TPQ/BPFB NPs（4 μM）在HeLa细胞中使用DCFH-DA作为总ROS荧光指示剂的ROS生成。比例尺=20 μm。（f）图4e中DCFH-DA相应荧光信号分析。（g）A/BPFB NPs和（h）TPQ/BPFB NPs处理HeLa细胞在有或无660 nm激光照射（0.25 W cm⁻²，10 min）下的活力。数据以均值±SD表示，每组n=3，***p<0.001。（i）不同实验组HeLa细胞活/死细胞染色结果。比例尺=100 μm。

机制上，研究通过TEM、细胞死亡抑制剂、Western blot、LDH释放、胞外ATP和CRT/HMGB1免疫荧光判断死亡方式与免疫原性信号。TPQ/BPFB NPs光照组出现细胞膜破坏、细胞器肿胀和线粒体空泡化等坏死性凋亡特征（图5a），凋亡、自噬和焦亡抑制剂不能挽救细胞，而坏死性凋亡抑制剂NSA、Nec-1和铁死亡抑制剂Fer-1可提高存活（图5b）；P-RIPK1、P-RIPK3和P-MLKL升高、GPX4下调（图5c），GSH降至16.4%，NADPH/（NADP⁺+NADPH）比值降至0.39，LDH释放达对照17.0倍（图5d），胞外ATP增加（图5e）并伴随CRT暴露和HMGB1核外转位（图5f），表明坏死性凋亡与铁死亡共同诱导ICD和DAMPs释放。

图5：（a）不同处理后HeLa细胞的TEM分析。红箭头指向线粒体。（b）在TPQ/BPFB NPs（4 μM）和不同细胞死亡抑制剂存在下，HeLa细胞接受660 nm激光（0.25 W cm⁻²，10 min）后的活力。数据以均值±SD表示，每组n=3，p<0.05，p<0.01，p<0.001。（c）磷酸化RIPK1（P-RIPK1）、磷酸化RIPK3（P-RIPK3）、磷酸化MLKL（P-MLKL）和GPX4的表达水平。（d）不同实验组HeLa细胞的LDH泄漏实验。数据以均值±SD表示，每组n=3，p<0.01，p<0.001。（e）不同处理后培养液中细胞外ATP发光强度测量结果。数据以均值±SD表示，每组n=3，**p<0.001。（f）不同处理后HeLa细胞中CRT和HMGB1的免疫荧光成像。比例尺=20 μm。

体内治疗中，研究设计如图6a所示，采用瘤内注射、NIR-II成像、660 nm激光照射和肿瘤体积/重量监测，并以H&E、TUNEL、CD31、GPX4和P-RIPK3染色评价疗效与机制。TPQ/BPFB NPs的肿瘤荧光信号随时间下降，原文归因于BPFB增强亲脂性、促进更深穿透（图6b），光照后肿瘤生长显著受抑，离体肿瘤最小、重量最低，抑瘤效果最佳（图6c-e）；H&E和TUNEL显示广泛肿瘤损伤和坏死，CD31显示血管生成受抑，免疫荧光显示GPX4信号消失、P-RIPK3信号增强（图6g），主要器官和血常规、肝肾功能未见明显异常。

图6：（a）肿瘤植入、NPs注射、激光照射和肿瘤生长监测的时间安排示意图。（b）注射TPQ/HFA NPs或TPQ/BPFB NPs后不同时间肿瘤区域荧光强度的相对变化。（c）不同治疗后相对肿瘤体积变化。数据以均值±SD表示，每组n=5，p<0.001。（d）不同治疗后离体肿瘤照片。（e）离体肿瘤重量和（f）小鼠在不同治疗期间的相对体重变化。数据以均值±SD表示，每组n=5，p<0.05，*p<0.001。（g）不同治疗后小鼠肿瘤的H&E染色、TUNEL、CD31免疫组化染色以及GPX4、P-RIPK3免疫荧光染色。

免疫激活方面，研究以流式检测脾脏成熟DC和T淋巴细胞、以ELISA检测血清细胞因子。TPQ/BPFB NPs光照组成熟DC比例达46.9%，高于TPQ/HFA NPs光照组的41.7%（图7b）；CD4⁺ T细胞比例达17.1%，CD8⁺比例达13.5%、为PBS光照组的4.64倍（图7c、d）；肿瘤组织CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润最广泛，TNF-α、IL-6和IFN-γ分别达到PBS光照组的1.57、1.46和1.42倍（图7e-g），说明DC成熟、T细胞激活和促炎因子分泌共同增强。

图7：（a）体内抗肿瘤研究的治疗时间表。（b）不同治疗后脾脏成熟DC的流式检测。（c）T淋巴细胞流式检测及相对群体，（d）不同治疗后脾脏CD4⁺、CD8⁺。数据以均值±SD表示，每组n=3，p<0.01，p<0.001。ELISA分析（e）TNF-α、（f）IL-6和（g）IFN-γ。数据以均值±SD表示，每组n=3，p<0.01，p<0.001。

抗转移评价中，研究在原发瘤治疗后48 h静脉注射4T1-Luc细胞模拟血行播散，15天后以肺生物发光和H&E评估转移负荷（图8a）。TPQ/BPFB NPs光照组肺荧光素酶信号最弱，生物发光强度降至PBS光照组的7%（图8b、c），肺切片中转移结节极少（图8d）；TPQ/HFA NPs光照组降至19%，而对照组可见广泛肿瘤结节，表明该光免疫治疗不仅抑制原发瘤，还通过系统性免疫有效减少肺转移。

图8：（a）TPQ/HFA NPs和TPQ/BPFB NPs介导治疗抗肺转移的时间安排。（b）检测4T1-Luc细胞荧光素酶信号以追踪不同组肺转移生长。（c）图8b中肺内荧光素酶信号强度分析。数据以均值±SD表示，每组n=4，*p<0.05。（d）H&E染色检查的肿瘤肺转移切片代表性图像。比例尺=1000 μm。

综上，该研究以全氟烷基阴离子替换反离子调控阴离子-π⁺型AIE光敏剂，BPFB凭借双侧全氟烷基链增强阴离子-π⁺和范德华作用、限制分子内运动，从而同步提升荧光、I型ROS生成、线粒体靶向和抗光漂白能力；TPQ/BPFB NPs在光照下同时激活坏死性凋亡和铁死亡，促进ICD、DC成熟和T细胞激活，并借助亲脂性实现更深肿瘤穿透，获得95%的原发瘤抑制率和显著降低的肺转移负荷。该策略为开发高效NIR-II阴离子-π⁺型光敏剂、克服肿瘤免疫抵抗和重塑肿瘤微环境提供了可行方向，也为实体瘤光动力免疫治疗提供了新思路。