一篇搞懂微生物组学，常见图表解读与差异菌验证思路

• 样本中有哪些微生物？

• 不同组的菌群结构是否不同？

• 哪些菌可能与疾病相关？

• 菌群发生了哪些功能变化？

• 这些变化是疾病的原因，还是结果？

• 如何通过实验验证菌群与表型之间的因果关系？

这就是微生物组学研究的核心。

图 1：https：//blog.csdn.net/qazplm12_3/article/details/145766930

什么是微生物组学？

首先来区分一下：

• 微生物群（microbiota）：某一环境中存在的微生物集合。

• 微生物组（microbiome）：不仅包括微生物本身，也包括其基因、功能及与宿主和环境之间的关系。

微生物组学研究常见样本包括：

其中，粪便样本相对容易获得，也是肠道菌群研究中最常见的样本。

常用的微生物组学技术有哪些？

拿到测序数据后，如何分析？

图 2：https：//www.oebiotech.com/index.php？c=show&id=1052

1、测序量是否足够？

首先查看每个样本获得了多少有效序列。如果大部分样本有足够的序列，而某个样本测序量极低，应排查：样本 DNA 量不足；DNA 降解；PCR 扩增失败；建库异常；样本中存在抑制物；测序质量不佳。

测序量明显偏低的样本，可能影响物种检出率和多样性分析。

2、稀释曲线是否趋于平稳？

稀释曲线用于判断当前测序深度是否覆盖了样本中的主要微生物。

如果曲线逐渐趋于平稳，说明继续增加测序量获得的新特征相对有限；如果曲线仍快速上升，则提示测序深度可能不足。

但稀释曲线平稳并不等于「所有微生物都被检测到」，它主要说明当前方法对主要群落的覆盖逐渐稳定。

3、样本是否存在批次效应？

可以通过 PCA、PCoA 或其他排序方法观察样本。

如果样本首先按照提取批次、建库批次或测序批次聚类，而不是按照疾病分组聚类，就需要警惕技术因素。

批次校正可以在一定程度上改善问题，但不能完全替代规范的实验设计。

微生物组结果图应该怎么看？

1、物种组成柱状图：样本中主要有哪些菌？

堆叠柱状图常用于展示不同样本或不同组中主要菌门、菌属或菌种的相对丰度。

每种颜色代表一种微生物；纵轴通常为相对丰度；图中展示的是组成比例，不是绝对数量。

例如，某种细菌的相对丰度升高，可能是它自身增加，也可能是其他细菌减少后造成的比例上升。

如果研究核心菌，最好结合定量 PCR、数字 PCR、培养或加入内标的绝对定量方法验证。

图 3：https：//blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/108526009

2、Alpha 多样性：一个样本内部有多丰富？

Alpha 多样性描述单个样本内部的微生物丰富度和均匀度。

常见指标包括：

Chao1：偏重物种丰富度；

Observed features：实际观察到的特征数量；

Shannon 指数：同时考虑丰富度和均匀度；

Simpson 指数：更关注优势菌的分布。

如果病例组 Shannon 指数降低，通常提示菌群多样性下降。

但多样性高并不总是代表健康。例如，某些低微生物量部位出现异常丰富的菌群，也可能提示污染或生态失衡。

图 4：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/2036094841986209251

3、Beta 多样性：不同样本的菌群结构是否不同？

Beta 多样性用于比较样本之间的群落差异，常用 PCoA 或 NMDS 图展示。

每个点代表一个样本：点越接近，菌群结构越相似；点越远，菌群结构差异越大；不同颜色通常代表不同实验组。

图 5：PCoA 图 https：//blog.csdn.net/qq_47369980/article/details/122644823

仅凭图中两组「看起来分开」不能证明组间存在显著差异，还需要使用 PERMANOVA 等方法检验。同时应检查组内离散程度。因为 PERMANOVA 显著有时可能来自一组样本更加分散，而不一定是两组中心真正分离。

图 6：https：//blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/107032032

4、差异菌分析：哪些菌发生了改变？

常见展示方式包括：箱线图；火山图；热图；LEfSe 柱状图；LDA 图；差异菌系统进化树。

某种菌在一组中只出现于一两个样本，即使计算结果显著，也不一定适合作为稳定标志物。

图 7：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/433315852

5、功能预测：菌群可能影响什么？

16S 数据可以通过计算方法预测菌群的潜在功能，例如氨基酸代谢、脂质代谢和能量代谢。但这种结果本质上是根据「检测到哪些细菌」推测「这些细菌可能具有哪些基因」。

它不是对功能基因、RNA、蛋白或代谢物的直接检测。重要功能应进一步通过宏基因组、宏转录组、代谢组或实验进行验证。

怎样从「差异菌」走向机制研究？

仅仅发现某种细菌在病例组中升高，通常不足以形成完整机制。

临床队列或者分组样本发现候选菌变化：→ 独立方法验证菌量→ 分析候选菌与临床表型的关系→ 找到相关代谢物或功能通路→ 细胞或动物实验验证表型→ 菌株、代谢物或受体干预→ 救援实验验证因果关系。

1、独立验证候选菌

可以采用：菌种特异性 qPCR；数字 PCR；荧光原位杂交；靶向宏基因组检测；独立临床队列验证。

2、验证候选菌的功能

可根据研究问题选择：菌群培养上清处理细胞；菌与细胞共培养；候选菌定植动物；抗生素清除菌群；粪菌移植；微生物代谢物补充或阻断。

3、找到真正的效应分子

很多情况下，微生物并不是直接作用于宿主细胞，而是通过代谢物、毒力因子或免疫分子发挥作用。

例如可以继续分析：候选菌是否产生特定代谢物；代谢物是否进入循环或局部组织；宿主细胞是否表达相应受体；阻断受体后表型是否消失；补充代谢物能否恢复表型。

微生物组学在科研课题中的常见应用

1、疾病标志物筛选

比较患者与健康对照，筛选具有诊断价值的菌群特征。

常见分析包括：差异菌筛选；ROC 曲线；多菌联合模型；与临床指标联合建模；外部队列验证。

2、药物疗效预测

采集治疗前样本，比较应答者与不应答者的菌群特征，可以寻找潜在的疗效预测标志物。

如果要证明菌群影响疗效，还需要进一步验证：候选菌是否具有独立预测价值；结果是否受抗生素和饮食影响；候选菌定植是否改变动物的药物反应；相应代谢物或免疫通路是否发生改变。

3、药物对菌群的调节作用

可设置：正常对照组；疾病模型组；药物干预组。

分析：模型中升高、药物后降低的菌；模型中降低、药物后恢复的菌；被药物逆转的微生物功能；与疾病表型同步恢复的代谢物。

需要进一步证明菌群依赖性，可考虑抗生素清除、粪菌移植或候选菌回补等实验。

4、菌群—代谢—免疫研究

这是目前较常见的机制设计。

基本逻辑为：菌群失衡→ 微生物代谢物改变→ 宿主受体或代谢通路变化→ 免疫细胞功能改变→ 疾病进展或治疗反应变化。

在课题中借助微生物组学分析，把「菌群发生变化」进一步发展为一条能够被验证、被干预，并最终解释疾病表型的机制证据链。

编辑：小 z

题图：图虫