《食品科学》：陈惠琴副研究员、朱婷婷副教授等：黄皮叶精油对变形链球菌的抑制作用及其机制

黄皮（Clausenalansium (Lour.) Skeels），别称wampee，是芸香科常绿乔木，广泛分布于广东、广西、海南、中国台湾和福建等地。黄皮素有“果中之宝”的誉称，其果实可鲜食亦可用于加工果酱、果脯、蜜饯及饮料等制品。在加工过程中，其叶片常作为加工废弃物被丢弃，导致资源利用率低下。然而，研究表明黄皮叶含有丰富的生物活性成分，包括生物碱、倍半萜类、酰胺类、芳香苷等，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖等多种药理作用，同时也是药食两用食材，具有广阔的高值化利用空间。

龋齿作为一种由糖类驱动、以微生物及生物膜介导的多因素动态疾病，其发病机制为牙齿矿物质与口腔微生物生态系统之间的平衡失调，从而引发脱矿所致，是全球最常见的慢性非传染性疾病之一，其高发率和反复性给公共卫生体系带来沉重负担。在龋齿发生与发展过程中，牙齿表面生物膜中的致龋菌群发挥关键作用，其中变形链球菌（Streptococcusmutans）被认为是主要的致病菌之一。该菌具有强黏附、快速形成生物膜、产酸等多种毒力特征，能够通过产生胞外多糖（EPS）促进菌斑结构稳固，从而加速牙面脱矿。因此，抑制变形链球菌的生长及其生物膜形成是龋齿防控的重要策略。

目前临床上常用的抗菌与防龋药物包括氟化物、氯己定（CHX）及部分抗生素等，然而这些传统药物在实际应用中存在如牙面着色、微生态失衡、口腔黏膜刺激、味觉异常以及长期使用导致的耐药风险等局限性。因此，探索来源可靠、安全且适合长期口腔应用的天然活性物质，已成为口腔微生态精准干预的重要研究方向。近年来研究显示，黄皮叶精油（WLEO）对口腔念珠菌感染具有潜在应用价值，其主要成分为β-石竹烯等倍半萜类化合物。Wu Zibei等比较了黄皮不同组织来源精油的抗菌活性，发现精油整体的抗菌效果明显优于其主要单体成分，并可下调变形链球菌的毒力相关基因（如brpA、gtfB、gtfC、gtfD），揭示其在龋齿防治中的潜在应用价值。然而，目前针对WLEO对变形链球菌整体代谢响应、生物膜结构稳定性及其内在调控机制尚缺乏系统性研究。

代谢物是基因表达的终产物，其变化能够敏感反映微生物在环境胁迫下的生理状态。非靶向代谢组学技术为解析天然产物的抗菌机制提供了新的研究视角，可从代谢通路扰动、能量代谢变化及膜结构稳定性等层面揭示其生物学效应。因此，海南热带海洋学院食品科学与工程学院的曹世浩、朱婷婷*，中国热带农业科学院热带生物技术研究所的陈惠琴*等结合抑菌指标与非靶向代谢组学分析，系统探讨WLEO对S. mutans的抑制作用机制，以期为开发安全、高效、基于天然产物的抗龋制剂提供实验依据与理论支持。

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WLEO成分分析

WLEO通过水蒸气蒸馏提取，500 g新鲜黄皮叶原料可得精油0.235 g，提取得率为0.047%。经气相色谱-质谱分析共鉴定出35 种成分（表1）。各成分保留时间主要集中在20～35 min（图1）。其中相对含量在5%及以上的主要成分有α-没药醇（15.25%）、反式-橙花叔醇（11.3%）、α-甜橙醛（9.81%）、β-石竹烯（8.44%）、γ-没药烯（6.95%）、β-没药醇（5.66%）、石竹素（5.23%）及(E)-α-檀香醛（5.00%）。

α-没药醇（C15H26O）是一种广泛存在于食用和观赏植物精油中的单环倍半萜类化合物，对白念珠菌等多种微生物具有抑菌活性。de Carvalho Galvão等研究表明，富含反式-橙花叔醇的精油及其活性组分对变形链球菌具有抑菌作用，其机理在于破坏生物膜，且起效浓度低。此外，有研究表明β-石竹烯有效抑制了变形链球菌生长，并对其生物膜相关因子具有抑制作用。由此推测，本研究中含有上述活性成分的WLEO对变形链球菌亦可能具有显著的抑菌活性。

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抑菌性分析

2.1 抑菌圈直径

从图2和表2可知，WLEO组形成明显的抑菌圈，其直径达到（22.33±0.74）mm，显著大于阳性对照组抑菌直径（（13.76±0.12）mm）（P＜0.05）。该结果表明，WLEO对变形链球菌表现出良好的抑菌活性。

2.2 MIC和MBC

采用刃天青微量稀释法测定了WLEO的MIC，结果如图3A所示，抑制溶液变为粉色的最低WLEO质量浓度，即MIC为2.5 mg/mL。然后从图3A的96 孔板内吸取MIC及以上质量浓度的菌悬液涂布于BHI固体培养基平板，培养24 h后如图3B所示，WLEO 5 mg/mL及以上质量浓度均没有菌落生长，因此MBC为5 mg/mL。

2.3 抑菌动力学结果分析

如图3C所示，处于对数生长期的阴性对照在0～12 h 的观察期内生长状况良好，而同时间范围内1/2MIC和MIC WLEO处理的变形链球菌生长受到不同程度地抑制，1/2MIC时表现为停滞期延长且最终菌量下降；而当质量浓度达到MIC时，细菌生长被完全抑制。上述结果表明，WLEO可有效抑制变形链球菌的增殖速率与生长能力，且呈浓度依赖性。

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WLEO对变形链球菌生物膜形成及活性分析

3.1 生物膜形成

变形链球菌可通过在牙齿表面形成生物膜显著增强其致病性。为探究WLEO对其生物膜形成能力的影响，本研究采用结晶紫法对生物膜总量进行定量分析。如图4A所示，WLEO处理后，变形链球菌生物膜形成量随质量浓度升高呈明显下降趋势，表现出良好的浓度依赖性。在MIC和2MIC条件下，生物膜量显著低于阴性对照与溶剂对照组（P＜0.05），说明WLEO可以有效抑制变形链球菌生物膜的形成。

3.2 生物膜活性

采用XTT法对生物膜活性进行评价，以各处理组吸光度占阴性对照组的百分比表示其活性。结果如图4B所示，随着WLEO质量浓度的增加，生物膜活性呈浓度依赖性下降趋势（P＜0.05），表明WLEO对生物膜活性具有良好的抑制作用。

3.3 活/死细菌染色

为进一步评估WLEO对生物膜内细菌存活状态的影响，采用活/死细菌荧光染色进行观察。如图4C所示，随着WLEO质量浓度升高，绿色荧光信号（代表活菌）逐渐减弱，红色荧光信号（代表死菌）呈渐进性增强，提示细菌细胞膜完整性受到破坏。进一步对荧光图像进行半定量分析（图4D）发现，WLEO处理组的死菌比例呈浓度依赖性上升。上述结果进一步表明，WLEO可显著降低生物膜内细菌活性。

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抑菌机制分析

4.1 WLEO对膜电位的影响

细胞膜完整性是维持细菌能量代谢和物质转运的关键结构屏障。为探讨WLEO对细胞膜功能的影响，首先检测了膜电位变化。WLEO可浓度依赖性地诱发变形链球菌细菌膜发生去极化。如图5A所示，经1/2MIC～2MIC处理后，膜电位敏感性探针罗丹明123的荧光强度显著下降，降幅为30.8%～54.4%（P＜0.05）。膜电位的降低通常反映细菌膜去极化的发生，这是一种重要的膜损伤类型。该结果表明WLEO可对变形链球菌的菌膜造成破坏，使膜出现明显的去极化现象。

4.2 WLEO对LDH活性的影响

LDH是变形链球菌的胞内酶，负责催化丙酮酸转化为乳酸。当细菌膜不完整或受损时，LDH会释放到菌体培养液中。LDH的释放被认为是细菌膜受损和通透性增加的可靠指标。如图5B所示，WLEO质量浓度为1/2MIC～2MIC，上清液中的LDH活性呈显著升高趋势（P＜0.05）。这表明WLEO能够穿透细菌生物膜并破坏菌膜结构，从而促使LDH释放。

4.3 WLEO对Ca2＋泄漏的影响

当细菌膜结构受损时，胞内Ca2＋可向胞外释放，导致培养液上清中Ca2＋含量升高，如图5C所示，随着WLEO质量浓度的增加，上清液中的Ca2＋含量也显著增加（P＜0.05），该结果与LDH释放实验结果一致，进一步表明WLEO可破坏变形链球菌的细菌膜完整性，导致膜通透性增强，从而引起胞内成分外泄。这些研究结果共同表明，细胞膜损伤是WLEO发挥抗菌作用的上游关键事件。

4.4WLEO对EPS的影响

EPS是变形链球菌黏附牙齿表面并形成致龋生物膜的关键毒力因子，其包含WSP和WIP。EPS为生物膜形成提供了三维支架，其中，WSP主要在生物膜初期阶段起关键作用，包括促进菌体初始黏附，增强菌体之间的凝集，为生物膜提供扩散基质。WIP是成熟生物膜三维结构的框架物质，起到维持生物膜机械强度、黏附牙面、保护深层菌体免受外界抗菌剂干扰的作用。

由于EPS的生物合成是一个能量依赖型过程，且与膜相关的代谢活动密切相关，因此进一步研究了WLEO诱导的膜损伤是否会影响EPS的产生。通过苯酚-硫酸法测定发现，WLEO能显著降低变形链球菌EPS的生成水平。如图5D、E所示，WLEO对WSP和WIP的抑制作用均呈现剂量依赖趋势（P＜0.05），在2MIC时，WLEO对WSP和WIP的抑制率分别达到65.14%和93.02%。该结果表明，WLEO显著降低WSP和WIP的合成，提示其可能通过干扰EPS的生成过程，减弱菌体表面疏水性及其黏附能力，从而抑制生物膜的形成与稳定性。结合前述膜损伤结果，推测膜去极化与通透性改变可能导致ATP供应下降及相关酶功能受限，从而抑制EPS合成。因此，WSP和WIP合成的抑制可能是膜功能障碍和代谢紊乱的下游结果。

综合以上结果，WLEO对变形链球菌及其生物膜的抑制作用并非单一靶点效应，而是通过多层级机制协同发挥作用（图6）：首先，WLEO中的疏水性组分与细菌细胞膜发生作用，导致细胞膜去极化、通透性增加，Ca2＋和LDH外泄可证实这一现象。细胞膜损伤进一步抑制ATP生成，引发能量代谢紊乱与脂质稳态失衡，进而抑制EPS（WSP、WIP）的能量依赖性合成，最终造成生物膜结构完整性破坏、生物膜解体及菌体失活。

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非靶向代谢组学分析

鉴于前述结果表明WLEO可显著抑制变形链球菌生物膜形成，并诱导膜电位下降、LDH释放增加及Ca2＋外泄等膜损伤现象，提示其可能在细胞代谢层面产生系统性干扰。为进一步阐明WLEO发挥抑菌及抗生物膜作用的分子基础，采用非靶向代谢组学技术对WLEO处理组与对照组变形链球菌进行检测，通过多变量统计分析、差异代谢物筛选及通路富集分析，系统解析WLEO对变形链球菌代谢网络的影响，从代谢调控角度揭示其潜在的作用机制。从而补充前期表型实验的机制研究不足，为阐明WLEO的抑菌机制提供分子层面的参考依据，同时为WLEO在天然抗龋领域的进一步研究提供思路。

5.1 非靶向代谢组学结果

QC样品在相关性分析中聚集紧密，表明检测体系稳定、数据重复性良好（图7A）。PCA结果显示，WLEO处理组与对照组在主成分空间中明显分离，组内样本聚集性良好（图7B）。进一步的OPLS-DA表明，两组样本在模型中实现清晰区分（图7C）。模型经200 次置换检验验证，拟合优度和预测能力指标分别为、Q2＝0.801，未观察到过拟合现象（图7D）。

基于OPLS-DA模型的VIP＞1且P＜0.05的筛选标准，共鉴定出884 种显著差异代谢物，其中上调548 种，下调336 种。差异代谢物主要分布于氨基酸及其衍生物、有机酸、醛酮酯类和脂质相关代谢物。聚类热图和火山图结果显示，WLEO处理组与对照组在整体代谢特征上存在显著差异（图7E、F）。关键差异代谢物如表3所示，上调代谢物包括丙酮酸、L-苹果酸和腺嘌呤等，下调代谢物包括吲哚、鸟苷和辛酸等。

基于筛选得到的差异代谢物进行KEGG通路富集分析。如图7G所示，多条代谢通路在WLEO处理组中显著富集，其中主要包括硫辛酸代谢、脂肪酸生物合成、色氨酸代谢、赖氨酸生物合成、丙酮酸代谢及嘌呤代谢等通路。上述结果表明，WLEO处理可引发变形链球菌多条基础代谢通路发生显著改变。

5.2 代谢通路与功能分析

5.2.1 WLEO对能量代谢的影响

WLEO处理显著扰动了变形链球菌的能量代谢网络，其中丙酮酸代谢通路变化尤为显著。作为连接糖酵解与中央碳代谢的关键代谢枢纽，丙酮酸在处理组中显著上调，而其向下游代谢途径的转化过程受到抑制，提示丙酮酸脱氢酶复合体（PDHc）的功能可能受到影响，进一步分析显示，硫辛酸代谢通路亦发生显著变化。硫辛酸作为PDHc的核心辅因子，在维持丙酮酸向下游代谢转化过程中发挥重要作用。本研究观察到，WLEO处理导致(R)-二氢硫辛酸水平显著下调，可能间接抑制硫辛酸生物合成，从而削弱PDHc的催化效率，影响丙酮酸在中央碳代谢中的进一步利用。此外，醋酸、苹果酸等下游代谢物的积累，进一步反映了以糖酵解为核心的中央碳代谢稳态的失衡，可能加剧细菌能量供应压力。

5.2.2 WLEO对脂质代谢的影响

代谢组学结果显示，WLEO处理显著影响了变形链球菌的脂质代谢网络。其中，脂肪酸生物合成通路变化最为显著，辛酸、十四烷酸、十六烷酸及十八烷酸等关键脂肪酸的代谢水平发生明显改变。鉴于脂肪酸是构成细菌膜磷脂的核心组分，其合成紊乱可能损害细菌膜的完整性、流动性及通透性。

5.2.3 WLEO对氨基酸代谢的影响

WLEO处理显著扰乱了变形链球菌体内多条氨基酸代谢通路。本研究共检测到11 种与色氨酸代谢相关的差异代谢物，其中色胺等4 种代谢物上调，以及吲哚等7 种代谢物下调。已有报道表明吲哚可通过调控能力刺激肽和sigX诱导肽等群体感应信号促进生物膜形成，因此吲哚代谢水平下调不利于生物膜的形成与维持。

此外，赖氨酸生物合成通路中多种代谢物（如N-琥珀酰-L,L-2,6-二氨基庚二酸）发生显著变化。赖氨酸是细菌合成膜蛋白和细胞壁肽聚糖的关键前体，其代谢通路的紊乱会进一步加剧WLEO对变形链球菌细菌膜完整性的破坏。

WLEO亦显著影响了缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸的合成与分解过程，表现为L-异亮氨酸及其关键中间代谢物水平发生显著变化。支链氨基酸不仅是细菌生长繁殖所必需的营养因子，还能参与能量代谢调控并与生物膜形成能力密切相关，因此，其代谢网络的紊乱可能通过限制蛋白质合成和能量供给，进一步抑制变形链球菌的生长繁殖与生物膜形成能力。

5.2.4 WLEO对嘌呤代谢的影响

非靶向代谢组学结果显示，WLEO处理显著扰动了变形链球菌的嘌呤代谢网络。嘌呤代谢不仅为核酸合成提供核苷酸前体，同时在维持细胞能量稳态和代谢平衡中发挥关键作用。本研究发现鸟苷与鸟嘌呤含量显著下调，二者是嘌呤“补救合成”途径的核心物质，其减少表明该通路可能受到抑制；与此同时，黄嘌呤、腺嘌呤等代谢物水平显著上调。这一结果表明WLEO可能通过阻断嘌呤再利用过程，干扰变形链球菌的核苷酸循环与能量供应。

结合非靶向代谢组学分析与细胞膜完整性检测结果，WLEO可通过破坏变形链球菌细胞膜结构启动其抗菌效应，进而引发中心碳代谢紊乱。并逐级干扰脂肪酸生物合成、氨基酸代谢及嘌呤循环等关键下游通路，由此造成的能量匮乏与生物合成受阻最终抑制EPS合成及生物膜成熟（图8）。基于多维度代谢扰动的调控机制，不仅揭示了WLEO发挥抗菌及抗生物膜活性的潜在分子机制，也为后续研发以代谢调控为靶点的新型防龋策略提供了实验依据与理论支撑。

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结 论

本研究发现，WLEO对变形链球菌具有优异的抑制作用，气相色谱-质谱分析表明，WLEO富含倍半萜及其含氧衍生物（主要为α-没药醇、反式-橙花叔醇、β-石竹烯等），该类成分疏水性强、膜亲和性高，可嵌入磷脂双层并破坏膜结构。结合生化指标检测与非靶向代谢组学分析结果发现，WLEO处理可引发变形链球菌细菌膜完整性受损，并伴随能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢及嘌呤代谢等多条关键代谢通路发生显著改变。上述多层级代谢扰动与生物膜抑制表型相互印证，共同导致菌体生长及生物膜形成能力下降。本研究为WLEO作为潜在食品源天然抗龋抑菌剂的进一步开发与应用提供了理论参考。未来研究将进一步构建WLEO递送体系，以更好地适应口腔微生态环境并评估其生物安全性，从而促进其在口腔健康管理中的应用转化。

引文格式：

曹世浩, 李婕, 张宇航, 等. 黄皮叶精油对变形链球菌的抑制作用及其机制[J]. 食品科学, 2026, 47(14): 94-104. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260105-020.

CAO Shihao, LI Jie, ZHANG Yuhang, et al. Inhibitory effect and mechanism of wampee leaf essential oil against Streptococcus mutans[J]. Food Science, 2026, 47(14): 94-104. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260105-020.

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实习编辑：陈师昀；编辑：阎一鸣；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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