中药入血成分鉴定如何做，有哪些问题需要注意？

情景重现

经常有小伙伴问我们，中药入血成分鉴定相关的问题。本期我们再给大家汇报下，中药的含药血清制备以及后续做入血成分鉴定相关的问题和注意事项：

1.

1.1实验动物的选择

采用正常动物或模型动物的血清均有，并且采用健康正常动物应尽量与模型动物一致。因此，选择健康动物还是模型动物需要进一步探讨。

1.2给药方案的选择

（1）给药剂量：若将含药血清看作一种药物，那么给药剂量取决于2 个方面：一是动物给药量，二是培养体系或反应体系中含药血清浓度。动物给药量换算公式为给药剂量＝人临床用量×动物等效剂量比值×培养液中血清稀释度，如果是做入血成分分析，可以适当提高给药剂量（5-10倍临床剂量换算）。

（2）给药、采血时间：目前有几种经验给药方案：1）7～10 d 给药法（每天 1 次，连续给药 7～10 d）；2）3 次给药法（连续 3 次，第 1、2 次间隔 20 h，第 2、3 次间隔 4 h）；3）2 次给药法（第 1 次给药后 2 h，再以相同剂量重复给药 1 次）等。采血时间一般在末次给药后 0.5～2 h，一般不超过 6 h，采血时间过早，部分药物组分未被吸收入血；采血时间过长，部分药物组分在体内发生转化或被排泄掉，理想的采血时间应落在药物达到稳态血药浓度期间。

1.3血清的处理

大部分研究人员对含药血清采用 56 ℃水浴加热 30 min的灭活方式，可以除去血清本身含有的补体等干扰实验的活性成分；也有研究人员将含药血清经乙醇、丙酮等有机试剂处理，通过使蛋白质变性去除血清中的酶、激素等，从而保留药物本身的作用。

具体可推文：《
2.中药含药血清制备及成分鉴定流程：

制备流程见下图：

2.1液相条件

采用配备ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm（内径）× 100 mm（长度）, 1.8 μm（粒径））（Waters Corp., MA, USA）反相色谱柱的Vanquish Flex UHPLC（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA）超高效液相色谱进行色谱分离。流动相由A相（水+0.1%甲酸）和B相（乙腈）组成，洗脱梯度参见表3，流速为0.3 mL/min。色谱柱温度为40°C。进样量为6.0 µL。

2.2质谱条件

采用配备热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪（Q Exactive™, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA）进行质谱分析。正、负离子的离子源电压分别为3.7 kV和3.5 kV；毛细管加热温度为320°C；鞘气压力为30 psi，辅助气压力为10 psi；溶剂加热蒸发温度为300°C；鞘气和辅助气均为氮气；碰撞气为氮气，压力为1.5 mTorr。采用Full scan/dd-MS2模式采集数据，Full scan参数：分辨率70000，自动增益控制目标1×106，最大隔离时间50 ms，质荷比扫描范围100 – 1500；dd-MS2参数：分辨率17500，自动增益控制目标1×105，最大隔离时间50 ms，质量分离窗口2，碰撞能10 V、30 V、60 V，强度限定1×105。

2.3数据分析

采用Progenesis QI 3.0软件（Waters Corp., MA, USA）处理采集的质谱数据，步骤依次为导入原始数据、峰提取、去卷积。搜索对照品数据库（TCM Pro 2.0）和理论数据库（通过文献、公共数据库等构建），通过对照品保留时间误差、母离子质量误差、二级碎片匹配、同位素分布、峰强度等对鉴定结果进行多维综合判断分析，得到最终结果。

2.4 结果案例

基峰图：

3.相关问题探讨

3.1 样本制备用什么品系的实验动物

R：一般选择SD大鼠。大鼠血清量大，灌胃温顺。也有选择后续药效评价造模动物的品系一致的。若选择健康动物灌胃，排除造模对中药吸收的干扰；若用造模动物灌胃制备血清，可以排除因批次不同，对动物吸收的影响。

3.2 动物灌胃剂量

R：一般中药都有临床剂量，选择正常动物可以5-10倍剂量灌胃，如果用模型动物，一般用高剂量来检测入血成分。

3.3 血清细胞药理学实验用含药血清还是冻干粉

R：一般选择含药血清开展后续细胞实验；也有部分地区的专家建议用冻干粉。目前没有统一，大部分老师会采用含药血清。

3.4 为什么要做入血成分鉴定

R：考察中药复方有哪些成分吸收进入血液循环。进一步可以考察入靶器官。不入血入靶器官的也有很多情况可能，比如小檗碱不入血，但入肠道。

3.5 入血成分原型没有检测到，那中药是如何发挥作用的

R：也有可能通过肠道菌群发挥作用。再结合脑肠轴、肺肠轴等发挥作用。

3.6 网络药理学用入血原型做还是原型+代谢物一起分析

R：将入血原型成分与代谢物共同纳入网络药理学分析是当前的主流和更优选择。这能最大限度地降低假阴性风险，确保你不会错过任何真正在体内发挥作用的活性分子。

4.中药成分及入血成分鉴定检测服务，欢迎联系我们

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