JEM丨LAG3+CD8+ T细胞的“奥德赛”：摆脱耗竭标签、赢得长期免疫记忆

在免疫系统与癌症的长期交锋中，持续不断的抗原刺激会逐渐将 T 细胞驱入一种被称为 “ 耗竭 ” （ E xhaustion ）的功能低下状态。然而， 一项在 2026 年 8 月 18 日在线 发表于 Journal of Experimental Medicine 的最新研究却给出了出人意料的结论【1】：部分已经耗竭的T细胞能够丢失耗竭标志物LAG3的表达，在肿瘤病灶外赋予持久的抗肿瘤免疫力。该研究同时首次建立了追踪此类细胞的新方法。

“ 以往人们的认识是，肿瘤内表达 LAG3 的 T 细胞不再具有任何功能 —— 它们要么原地停滞，要么走向死亡， ” 该论文的通讯作者、匹兹堡大学医学院免疫学系主任、 Frank Dixon 讲席 教授 Dario A. A. Vignali 表示 , “ 因此，当我们发现这些细胞实际上能够驱动长效免疫记忆时，既感到意外，也 备 受鼓舞。这一发现对以 LAG3 为靶点的肿瘤免疫治疗具有潜在的转化意义。 ”

随着耗竭程度不断加深， T 细胞会在其表面逐渐累积多种抑制性受体（ inhibitory receptors ） —— 这类分子的作用是抑制细胞自身的活化与效应功能 —— 其中包括 PD1 、 TIM3 和 LAG3 。 Vignali 团队，包括共同第一作者Vaishali Aggarwal、Yangxi（ Claudia ）Sun与Chang Liu（刘畅，现为南京大学现代生物研究院研究员） 在 Journal of Experimental Medicine 发表论文： Tumor-reactive LAG3+CD8+T cells diverge into terminally exhausted cells and long-lived memory cells 。论文揭示了 T 细胞在 转录激活 Lag3 之后，究竟走向了何方？

1.缘起：新颖的耗竭T细胞谱系追踪模型

为回答 耗竭 T 细胞（以表达 LAG3 作为标志）的长期命运决定 这一问题， Vignali 团队 构建了一种新的小鼠模型 （ Lag3 iCreERT2 Rosa26 LSL-tdTomato ， Fig.1A ） ，用以追踪并绘制 这群细胞 的命运图谱。当给予小鼠药物 T amoxifen （用于激活启动诱导型 CreERT2 元件介导 遗传标记的小分子）时，彼时 处于 L ag 3 转录活跃 的细胞会被诱导产生 tdTomato （ tdT ） 红色荧光蛋白。由于只有在给药 时间窗口（仅 3 天）内 表达 Lag3 的细胞才 能够启动 Cre 介导的重组 而 被标记为红色， 并永久表达 tdT ， 此后即使这些细胞关闭 Lag3 转录 抑或 失去表面 LAG3 蛋白， tdTomato 仍然保留。从而能够实现 对这群细胞的 持续追踪 ––– 这正是 遗传谱系示踪（ lineage tracing ）策略的核心思想。

在 B16 . F10 黑色素瘤中，作者 在系统评价 了一系列 诱导标记的 时间窗口 （ tamoxifen dosing scheme ） 后， 确定选择在 肿瘤接种后第 8 ~ 10 天 进行诱导—— 于 B16 . F10 模型而言，这是肿瘤反应性 T 细胞活跃进入肿瘤病灶，开始呈现典型的耗竭样分化（如表达 TOX ） 的关键时期 。 此后对于在这个标记窗口内表达 tdT 的细胞及其子代进行长期追踪 ，研究者获得了两项出人意料的发现：其一，部分 tdT + 丢失膜表面 LAG3 表达 ，即出现了两个 tdT + CD8 + T 细胞群体： LAG3 + tdT + 和 LAG3 − tdT + ；其二，后者，即 “ 单阳性 ” （ single-positive , SP ） T 细胞不但存在于肿瘤，还可长期存活于淋巴结及外周组织。与之形成鲜明对照的是， “ 双阳性 ” （ double-positive , DP ）细胞 —— 既携带 td T 标记、又持续表达膜表面 LAG3 的细胞 —— 仅见于肿瘤内部。 两群细胞鲜明反差的 空间分布 特征 提示 一个 颇具 “ 反常识 ” 意味的 可能性 ： 肿瘤中的 耗竭 T 细胞 并非都走在一条 “ 不归路 ” 上，其中一部分，若能 先行丢失 LAG3 ， 是否 将 离开肿瘤微环境 获得长期生存 ？

进一步的表型分析显示， LAG3 + tdT + 细胞富集 PD1 高表达以及由 LY108 – TIM3 + 所定义的终末耗竭表型； LAG3−tdT+ 细胞则保留更多耗竭前体样细胞 （ T PEX ） 特征。因此， LAG3– tdT + （ SP ） 细胞并 非因 膜表面 LAG3 表达 过低、无法被 被 LAG3 抗体 检出而造成的假象 ，而是在最初被 tdT 标记后， 沿着与 LAG 3 + tdT + （ DP ）细胞显著不同的表型演化的另一群 tdT + 亚群。那么，这些丢失了 LAG3 的单阳性细胞，它们的分化起源是什么，在肿瘤之外究竟在做什么？它们能否影响机体针对肿瘤细胞的免疫记忆？

2.溯源：多组学联合身份鉴定与功能追踪

两群 tdT + 细胞呈现显著表型差异， 提示了在 逻辑上互斥的 两个 分化起源 可能性 ： 1. 独立起源且独立分化； 2. 共同起源但 随时空进展 独立分化。 对此， 作者联合使用多组学分析，包括单细胞转录组 联合 TCR 免疫组 库 测序 和 染色质可及性测序 （ ATAC - seq ） ，辅以 过继转移 代表的功能 实验， 对 上述两种假说 进行深入鉴别 。

本工作 在单细胞转录组分析实验设计上 颇具考量，区别于仅对单一时间点细胞状态的捕获（ snapshot analysis ），作者在肿瘤进展全程的多时间点取材 ，进行 连续追踪分析（ longitudinal analysis ） 。 尤其 是精准截取关键时间点，包括 D11 （ Tamoxifen 诱 导 tdT 表达的最早时间点）， D19 （原位瘤进展终末期），原位瘤切除后 D60 （免疫记忆 形成和 维持），从而得以全景式呈现两群 tdT + 细胞的发生和分化轨迹。

这套分析的信息量是巨大的。首先，转录组 分析 与早期的表型 鉴定 高度相符，两群 tdT + 细胞的状态随肿瘤进展以及所处生理学位置的不同（瘤内或外周）呈现显著差异的命运选择，肿瘤内 LAG3 + tdT + 细胞 呈现细胞毒以及终末 耗竭相关 特征 ；部分 LAG3 − tdT + 细胞留在肿瘤后也逐渐向更深的耗竭状态靠近。与此同时，进入外周的 CD44 + tdT + 细胞逐步 富集 naive/stem-like memory 相关特征。然而转折点在于，肿瘤内 LAG3 + tdT + 、肿瘤内 LAG3 − tdT + 以及外周 CD44+tdT+ 细胞之间出现广泛的 TCR 克隆共享。尤其到较晚时间点，外周 tdT + 细胞中扩增的克隆与肿瘤内 tdT + 细胞具有明显重叠。这些结果说明不同群体并非彼此独立产生，支持它们具有共同的克隆来源。表观遗传（染色质可及性）分析则 进一步有力支持了 共同起源，随时空进展区分演化 这一可能性， 肿瘤内 LAG3 − tdT + 与 LAG3 + tdT + 细胞的整体 染色质 可及性高度相似。肿瘤内 LAG3 − tdT + 细胞与肿瘤内 LAG3+tdT+ 细胞呈现约 80% 的特异性开放染色质区域（ Accessible Chromatin Regions, ACRs ）重叠，而与 肿瘤 引流淋巴结 （ tumor-draining lymph nodes, tdLN ） LAG3 − tdT + 细胞的重叠约为 50% 。这一结果与转录组结果相互支持：决定后续状态的不只是细胞是否曾经表达LAG3，还包括它之后持续处在肿瘤还是进入外周。

过继转移功能实验 进一步 佐证 LAG3 + tdT + （ DP ） 细胞失去 细胞膜 LAG3 表达而产生 LAG3 − tdT + （ SP ） 后代。 作者 从 B16 . F10 肿瘤 （ D11 ）中分选得到 LAG3 + tdT + CD8 + T 细胞 ， 再通过瘤内注射 将这些 DP 细胞 直接转移至荷瘤受体鼠的肿瘤中 。 5 天后，受体肿瘤中可以检测到由这些供体细胞产生的 LAG3 − tdT + 群体， 而且， 部分受体 鼠 的淋巴结中也能够检测到 呈 LAG3 − tdT + 表型的 供体 来源 细胞。 这一实验为以下两点提供了直接证据 ： 1. DP  SP 的分化路径可能是 LAG3 − tdT + 细胞产生的 关键 机制； 2. 瘤内两群 tdT + 细胞中，只有 SP 细胞 能够 迁移至外周 ，不但长期 保持 其 LAG3 − tdT + 的身份标签，还获得干性样细胞的基因转录特征 。

3.求索：失去表面LAG3蛋白的SP细胞，获得了什么？

研究者随即追问：这些丢失了LAG3的单阳性细胞，在肿瘤之外究竟在做什么？它们能否影响机体针对肿瘤细胞的免疫记忆？为验证这一点，研究团队 采用了评价肿瘤特异性免疫记忆的 “ 金标准 ” 实验模型【2】： 手术切除小鼠的 原位 黑色素瘤，待 30 天 后，再以同种黑色素瘤细胞对动物进行二次接种（ rechallenge ）。 这个模型的核心逻辑是，功能性的肿瘤特异性 免疫记忆 能够有效抑制 二次接种所 导致的 肿瘤 生长 。

由于手术切除原位瘤仅仅移除了肿瘤内的 tdT + 细胞，而存在于 tdLN 中的 SP （ LAG3 – tdT + ）则不受影响，这个模型 为评价这些细胞长期功能提供了绝佳的生理场景 （ context ）， 而且不受 DP 细胞的交叉干扰（ DP 细胞 因原位瘤的切除而不再存在）。这一实验策略把研究者导向了一系列重要的发现：

首先， 由于早期的 Tamoxifen 标记（原位瘤时期 D8~10 ，较之 PBS 对照组），在 rechallenge 所 诱导的二次肿瘤中检测到了 可观比例 的 tdT + 细胞，它们再次呈现或 LAG3 + 或 LAG3 – 的异质性，且重现了在原位瘤中这两群细胞的表型特征， 即 LAG3 + 较之 LAG3 – 的 tdT + 细胞 呈现 更为终末 耗竭的 分化 特征。关键点在于， 这些浸润二次肿瘤中的 tdT + 细胞只可能来源于原位瘤切除后 30 天中一直保留在 tdLN 中的 SP （ LAG3 – tdT + ）细胞 。 毋庸置疑 ，这些细胞呈现经典的记忆样 T 细胞的功能属性 ： 1. 不依赖抗原的长期生存； 2. 能够再次响应二次抗原激活并迅速迁移至免疫部位。

其次， 这群在外周的 SP 细胞，是否在功能上参与对二次肿瘤 生长的控制 ？答案是肯定的， 一旦选择性清除 tdT 单阳性 CD8+ T 细胞，肿瘤的生长便显著加快 —— 这表明，正是这群细胞对于持久的抗肿瘤免疫不可或缺。 值得强调的是，精准清除 SP 细胞再次 得益于 谱系追踪工具的便捷 和巧妙 ：研究团队在 Lag3 iCreERT2 Rosa26 LSL-tdTomato 小鼠中引入 Rosa26 LSL - DTR 等位基因，即 获得 Lag3 iCreERT2 Rosa26 LSL-tdTomato Rosa26 LSL- DTR 小鼠，因此 Tamoxifen 的标记不但诱导表达 tdT ， 还同时 ” 安插 ” 了今后可以靶向清除它们的抓手： DTR （ diphtheria toxin receptor, 白喉毒素受体 ） 。通过在二次肿瘤接种前给予白喉毒素（ DT ），即可测定 SP 细胞存在与否对于二次肿瘤生长的影响 —— 上述关键结论正是由此获得。

4.余音：复盘与未来方向

标志蛋白启动子驱动的谱系示踪策略在免疫细胞生物学研究中已被广泛使用，经典案例包括 Foxp3 CreERT2 Rosa26 L SL-YFP 模型【3】，极大助力了 Treg 谱系稳定性探究及其调控机制的发现。这类系统也催生了“ Ex ” 细胞的提法，例如“ ExTreg ” , “ ExTh17 ”等，用于描述 既定 分化亚群在特定环境中发生状态演变而改变其身份，即 谱系 可塑性 （ lineage plasticity ） 。但是在这个工作中，通篇 没有 将 LAG3 – tdT + （ SP ） 细胞称作 “ Ex Lag3 “ 细胞 。诚然，这些 SP 细胞 丢失的 仅 仅 是表达在膜表面的 LAG3 蛋白，这可能来源于多重原因，包括 Lag3 基因转录终止（类似“ ExFoxp3 ” ）， 也可能是膜表面 LAG3 被蛋白酶 切割 脱落（ shedding ）【4, 5】。也就是说， SP 细胞 也并非单一亚群，而是仍 具有异质性，包括了 Lag3 转录表达失活和 持续 活跃的混合群体。然而区分上述可能性在本工作的科学语境中并不 关键 。考虑到 LAG3 蛋白的核心属性是细胞表面受体，膜表面的 LAG3 决定了细胞 感知环境 信号的差异，这也 是 为什么 SP 与 DP 细胞一旦产生就注定会走向不同命运_ 它们对环境的应答方式不再相同。 重要的是，当下已进入临床抑或在研中的 LAG3 单抗均只能靶向膜表面 LAG3 阳性（即本工作中的 DP ）细胞，完美“豁免”了这群能够赋予宿主肿瘤特异性免疫记忆功能的 LAG3 – tdT + 的 SP 细胞。 转录开启 Lag3 表达并不是耗竭 T 细胞的“原罪”， 相反可能 是 之后免疫记忆 功能所必需，但 关键是它们能够 适时地摆脱其表面的身份标签。

肿瘤是否是 SP 细胞产生的“第一现场”或“唯一现场”，这个问题 是 本 工作深入探究和论证 的重点 ， 核心 推论是： LAG3+tdT+ （ DP ）细胞是 Lag3 转录活性细胞被 标记 到 的起点状态，且 这一标记事件 发生在肿瘤内 。 SP 的产生是 DP 细胞丢失膜表面 LAG3 蛋白的直接后果，也 因此 开启了两群细胞在时空上“背道而驰”的分化路径，尤其是 SP 细胞能够离开肿瘤并获得干性样细胞的表型和 功能。支持该故事线的关键证据包括 DP 细胞的过继转移实验， DP 与 SP 细胞在全基因组染色质开放性特征上的高度重叠，以及 DP 和 SP 细胞在 TCR 克隆上的高频率共享。然而上述证据仍然不 足以 排除 另一可能性：在启动 示踪 之时， 即 Tamoxifen 给药窗口，在 tdLN 已有 少量肿瘤应答性 CD8+ 细胞开启 tdT 标记 ，然而它们尚未呈现膜表面 LAG3 阳性， 换言之，它们自始即为 SP 身份 。而这群细胞在之后的长期追踪过程里始终以干性样细胞或耗竭前体细胞的方式贡献宿主的记忆样细胞池（ memory-like cell pool ），并参与对二次肿瘤生长的影响。 而 这个在 本 工作里未能充分排除的可能性， 反而 与领域中广泛认同的 tdLN 是肿瘤免疫应答中干性样细胞产生的 解剖学 部位的观点是 是 契合的【6-8】。

所谓余音绕梁，一项研究发表的意义，不在 于 完结，而是开启更多重要的问题。而对于肿瘤免疫治疗而言，正如本文通讯作者 Dr. Dario V ignali 指出，许多癌症患者在接受免疫治疗后仍会复发，其原因恰恰在于机体未能建立起足够强健而持久的记忆性免疫应答。 “ 能否产生一种长效的、靶向肿瘤的记忆性应答，对于实现有效且持久的肿瘤免疫治疗至关重要， ” 他表示， “ 我们目前正在探索：阻断 LAG3 是否会提高耗竭 T 细胞的迁移能力，从而促使它们离开肿瘤、在外周组织中播散，并由此建立起长期免疫。 ”

这些发现有望为改进以 LAG3 为靶点的免疫治疗策略提供新的思路。

原文链接：doi:10.1084/jem.20241968

制版人： 十一

参考文献

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8. Huang, Q., Wu, X., Wang, Z., Chen, X., Wang, L., Lu, Y., Xiong, D., Liu, Q., Tian, Y., Lin, H., et al. (2022). The primordial differentiation of tumor-specific memory CD8(+) T cells as bona fide responders to PD-1/PD-L1 blockade in draining lymph nodes.Cell185 , 4049–4066 e4025. 10.1016/j.cell.2022.09.020.

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