双网络水凝胶，登上Nature大子刊！

污水处理看似是在“净化水”，背后却同样伴随着不小的能源和碳排放成本。传统硝化—反硝化过程不仅需要大量曝气，还常常要额外添加有机碳源，使污水处理成为全球温室气体排放的重要来源之一。厌氧氨氧化（anammox）技术因此被视为低碳污水脱氮的重要突破口：厌氧氨氧化菌可以直接以亚硝酸盐为电子受体，将铵转化为氮气，不需要有机碳源。但它有一个长期存在的“尾巴”——反应过程中会产生一定量的硝酸盐，理论上约相当于进水总氮的11%。如果想进一步把硝酸盐去掉，就必须让厌氧氨氧化菌与反硝化菌有效“合作”。问题在于，微生物之间距离太远、代谢物容易扩散流失，这种合作往往很难稳定建立。

针对这一难题，天津大学赵迎新教授团队提出了一种很有意思的思路：不再任由微生物随机聚集，而是利用3D生物打印把厌氧氨氧化微生物群落“打印”成工程活体材料（ELMs）。通过空间限域，一方面把关键菌群拉得更近，另一方面把它们产生的氨基酸、多糖、辅因子等“公共代谢物”留在局部，让厌氧氨氧化菌和反硝化菌之间真正形成高效的交叉喂养。最终，这种3D打印活体材料将系统启动时间缩短了71.43%，并且在不额外补充有机碳源的情况下实现了100%的总氮去除，相关效果还在真实废水中得到了验证。相关成果以“3D-printed living materials for anammox–denitrification coupling in wastewater treatment”为题发表在《Nature Sustainability》上，Yinuo Liu为第一作者。

研究首先要解决的是一个非常实际的问题：细菌怎么“打印”出来，还能活着工作？作者选择海藻酸钠和纤维素构建生物墨水，其中两者比例为1:1时，在打印性能、细胞活性和传质之间取得了较好平衡（图1a、b）。海藻酸钠与纤维素之间通过氢键形成网络，再利用Ca²⁺与羧酸基配位进一步交联，得到稳定的双网络水凝胶。XRD、FTIR和XPS结果共同证明了这一网络结构和Ca²⁺配位作用的形成（图1c–e）。更重要的是，这套体系主要由天然、可再生高分子组成，相比传统石油基载体，也更加符合低碳污水处理的材料逻辑。显微结构进一步说明，微生物并不是简单“埋”在凝胶里。AFM和SEM可以看到，细菌被限制在多孔网络中，相邻微生物团簇距离可以缩短到4 μm以内，同时材料内部仍保留大量孔道用于污染物和代谢物传输（图1f）。当然，凝胶也不能一味追求“越硬越好”：Ca²⁺交联30–60 min虽然能提高力学性能，却会明显抑制厌氧氨氧化菌活性，因此作者最终选择15 min作为平衡点，此时材料拉伸强度约为0.79 MPa（图1g、h）。与此同时，血红素c含量持续升高，说明厌氧氨氧化菌能够在材料内部快速增殖（图1i）。

图1：3D打印厌氧氨氧化工程活体材料的构筑

真正关键的变化出现在脱氮性能上。游离微生物体系需要大约35天才能达到稳定运行，而且硝酸盐始终保持在厌氧氨氧化反应理论上难以避免的水平。相比之下，两种打印密度的ELMs在培养5天后，总氮去除效率就迅速提升；到第10天，铵态氮和亚硝态氮已经接近检测限，启动时间由35天缩短至约10天，相当于减少了71.43%（图2a）。更突出的是，游离菌体系只能维持在理论最大脱氮水平附近，而ELMs却能够长期实现接近100%的总氮去除（图2b）。为什么把细菌“打印得更密”反而不会妨碍传质？COMSOL模拟给出了答案。高打印密度结构形成了更加复杂而有序的微通道，使流体扰动和底物扩散得到增强（图2c）。实验也发现，ELMs内部细胞摄取到的NH₄⁺和NO₂⁻明显更多，其中高密度打印组表现尤其突出（图2d、e）。也就是说，空间限域并不是简单把细菌塞到一起，而是同时优化了“人与人之间的距离”和“食物送到人手里的路径”（图2f）

图2：3D打印ELMs显著提升脱氮性能

这种空间环境还直接改变了微生物的代谢状态。共聚焦成像显示，打印后14天内活细胞荧光强度提高了57.71%（图3a、b）。与此同时，ELMs的电化学电容、电子传递系统活性以及细胞色素c、辅酶Q含量均明显增加，并带来了更多ATP生成（图3c–f）。与厌氧氨氧化直接相关的HZS、HDH和NIR等酶活性也同步增强（图3i）。更有意思的是，ELMs中FAD和FMN等黄素类电子穿梭体显著增加（图3g、h）。它们并不直接参与厌氧氨氧化，却能够促进反硝化过程中的电子传递。与此同时，硝酸盐还原酶活性大幅提升，而亚硝酸盐还原能力只适度增加，这使反硝化菌更多“吃掉”厌氧氨氧化产生的硝酸盐，而不是去大量争夺亚硝酸盐。于是，一个原本容易相互竞争的微生物体系，被空间结构重新组织成了更加互补的合作关系（图3j）。

图3 ：空间限域激活微生物代谢与电子传递。

宏基因组分析进一步找到了这种合作背后的关键角色——Opitutus属细菌。在3D打印ELMs中，厌氧氨氧化相关基因、反硝化相关基因以及氮转运基因均得到增强（图4a）。与此同时，Opitutus富集了大量与辅因子、次级代谢物以及碳代谢相关的基因（图4b–e）。其中一个关键细节是：厌氧氨氧化菌自身并不擅长合成钼辅因子和叶酸，而Opitutus却具有完整合成通路，可以把这些重要“代谢零件”提供给厌氧氨氧化菌。这种交换并不是单向的。厌氧氨氧化菌又能够大量合成氨基酸和胞外多糖，而Opitutus拥有丰富的肽酶、糖苷水解酶和糖代谢基因，可以把这些产物转化成自身反硝化所需要的碳源和能量（图4c、f）。与此同时，3D限域还增强了群体感应相关基因表达（图4g），等于不仅让这些微生物“住得更近”，还让它们彼此之间的化学“交流”更加顺畅。

图4：宏基因组揭示厌氧氨氧化菌与Opitutus的交叉喂养

代谢组结果给这一机制补上了最后一块拼图。与游离菌群相比，ELMs中与电子传递、膜转运有关的代谢物，以及多种氨基酸、维生素和次级代谢物都明显富集（图5a–c）。其中，多糖含量由游离体系的约21.70 mg gVSS⁻¹，提高到高打印密度ELMs中的61.68 mg gVSS⁻¹。过去这些代谢物很容易随着水流跑掉，如今却被水凝胶“留”在微生物附近，于是原本容易流失的代谢副产品，反而变成了菌群之间可以反复利用的“公共资源”。

图5：代谢组证明“公共代谢物”被有效保存。

作者最终将整套机制总结在图6中：3D打印首先利用海藻酸钠/纤维素网络把菌群限制在微米尺度空间内（图6a），随后形成了一条双向“物质交换链”（图6b）。厌氧氨氧化菌向Opitutus提供氨基酸和多糖，后者将多糖分解为单糖，经糖酵解和三羧酸循环产生NADH等电子供体，从而驱动硝酸盐反硝化；与此同时，Opitutus又向厌氧氨氧化菌提供叶酸和钼辅因子，支持其碳固定和能量代谢。这样一来，原本各自为战的微生物，被重新组织成了一个真正的“代谢共同体”。

图6：3D空间限域驱动的协同脱氮机制

小结

这项工作的意义因此不只是做出了一块能够脱氮的3D打印水凝胶。它更重要的启示是：微生物处理性能不仅取决于“有哪些菌”，还取决于“这些菌被放在哪里，以及它们产生的物质能不能留下来”。通过3D生物打印主动设计菌群空间结构，研究者将过去随机形成的微生物生态转变为可工程化调控的活体材料。作者也指出，目前体系仍需要进一步解决低温、毒性冲击、长期Ca²⁺交联稳定性、孔堵塞和群落漂移等问题。但这一“空间限域+代谢共享”的策略未来不仅有望用于工业和市政废水脱氮，也可能延伸到低碳氮比废水处理、高值发酵以及污染物生物降解等领域。