Nature Biotechnology | 一个纳米孔，开始同时“读”氨基酸、核苷酸、糖和肽

引言

如果想分析DNA，我们已经习惯了测序；如果想研究蛋白质，往往想到质谱（mass spectrometry, MS）；如果对象换成糖链（glycan），分析方法又会完全不同。

问题在于，生命系统并不是按照“核酸、蛋白质、糖”分别运行的。大量生物学过程恰恰发生在这些分子的交汇处。那么，有没有可能设计一种传感器，让不同类型的生物分子从同一个检测入口被识别？近日，《Nature Biotechnology》的研究报道 “An engineered nanopore identifies saccharides, amino acids, peptides and ribonucleotides”，给出了一种值得关注的方案：研究人员改造了MspA纳米孔，使同一个纳米孔能够识别氨基酸、核苷酸单磷酸、单糖、肽以及部分化学修饰，结合机器学习后，对40种分析物的总体分类准确率达到 98.7%。这并不意味着“一个纳米孔已经可以完成蛋白质、RNA和糖链测序”。但它提出了一个更基础、也可能更重要的问题：不同组学的分子，能否共享同一种单分子识别机制？

为什么DNA能穿过纳米孔被读取，蛋白质和糖却困难得多？

纳米孔测序（nanopore sequencing）的核心思想并不复杂。

当一个纳米尺度的孔道嵌入膜中并施加电压后，离子会持续通过孔道形成稳定电流。当某种分子进入或与孔道发生相互作用时，离子流就会改变。不同分子的体积、电荷、结构和化学性质不同，因此产生的电流变化也不同。

换句话说，纳米孔并不直接“看见”分子，它读取的是分子留下的电流事件特征（event signature）。

DNA和RNA相对适合这种模式，因为它们由有限种类的核苷酸按照线性序列连接。但蛋白质由更多类型的氨基酸组成，而且侧链性质差异显著；糖链则更加复杂，不仅存在大量单糖类型和异构体，还经常形成分支结构。

因此，直接让完整蛋白质或糖链穿过纳米孔并逐个读取单体，难度远高于DNA。

一种解决思路是外切测序（exo-sequencing）：先利用水解酶逐个释放蛋白质、RNA或糖链末端的单体，再让纳米孔识别这些被释放出来的分子。问题随之转化为：有没有一种纳米孔，既能识别氨基酸，又能识别核苷酸，还能识别糖？

这正是这项研究试图解决的问题。

关键改变不是换一个孔，而是在孔里装入一个“通用化学接口”

研究使用的是来源于耻垢分枝杆菌的孔蛋白 MspA（Mycobacterium smegmatis porin A）。

MspA并不陌生。它具有非常狭窄的孔道限制区域（pore constriction），此前已经被用于DNA以及多种小分子的纳米孔研究。

这一次，研究人员做了一件关键的事情：在MspA最敏感的限制区域，引入一个专门设计的分子适配器——maleimido-C2-formylphenylboronic acid，简称maleimido-C2-FPBA，最终形成MspA-FPBA。

这个FPBA适配器的重要之处，在于它能够通过两套可逆化学反应与不同分子结合。

对于氨基酸以及肽，FPBA可以与α-氨基或肽的N端氨基反应，形成亚胺硼酸酯（iminoboronate）；而对于单糖和核苷酸单磷酸（nucleoside monophosphate, NMP），FPBA又可以识别其中的顺式二醇（cis-diol），形成硼酸酯（boronic ester）。

两类反应都具有动态可逆性。

于是，同一个识别位点不再只针对某一种分子，而是拥有了
跨越多个分子类别的化学识别能力。

研究人员甚至可以直接从电流中看到改造过程：未修饰MspA的开孔电流约为 490 pA；FPBA加入后，电流突然下降约 160 pA，最终稳定在约 332 pA，提示适配器已经进入孔道限制区域。

一个纳米孔，能把21种氨基酸逐一区分吗？

接下来才是更关键的测试。

研究人员首先检测了 21种蛋白源性氨基酸（proteinogenic amino acids），其中包括硒代半胱氨酸（selenocysteine）；随后又检测4种经典NMP：AMP、UMP、CMP和GMP，以及4种单糖。

结果显示，不同分析物会产生具有不同形态的电流事件。

这种差异并不只是“电流下降得多还是少”。

研究人员提取了电流阻断幅度ΔI、噪声幅度SD、驻留时间（dwell time）、局部SD比值、最大值、最小值、范围、偏度（skewness）和峰度（kurtosis）等多个特征。

一个分子的身份，由此变成一个多维的“电信号指纹”。

值得注意的是，MspA-FPBA甚至能够区分亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）。这两个氨基酸是结构异构体，分子质量相同，因此一直是传统质谱分析中较麻烦的一对对象。研究中的纳米孔事件却表现出了足够的差异。

这说明纳米孔获取的信息，并不完全等同于分子质量，它同时受到分子的空间结构以及分子与孔道之间相互作用的影响。

98.9%的准确率，并不是靠“看波形”得到的

随着分析物数量增加，依靠人工判断电流事件显然不可行。

于是机器学习（machine learning）开始发挥作用。

研究人员首先收集了 5400个已知标签的纳米孔事件，并从每个事件中提取9个特征，构成九维特征矩阵。随后比较了K近邻（KNN）、支持向量机（SVM）、朴素贝叶斯、决策树、神经网络、判别分析和集成学习等7类模型。

采用十折交叉验证（tenfold cross-validation）后，袋装树模型（bagged trees）表现最好，验证准确率达到98.9%。

一个有意思的现象是，仅观察ΔI和SD时，甲硫氨酸（Met）与脯氨酸（Pro）的事件存在一定重叠；但将9个特征同时交给模型后，两者的识别准确率分别达到 99.4%和98.8%。

而当输入事件达到至少 1368个时，模型准确率已经达到 98.1%。

随后，研究人员继续加入3种翻译后修饰氨基酸、3种表观遗传修饰NMP以及5种肽。

分析对象由最初的29类扩展到 40类。

模型的总体准确率仍达到 98.7%；
40种分析物的分类准确率全部超过 92.5%，其中 18种达到100%。

这组结果说明，比“某个分子的单一电流值是多少”更重要的是：不同分子能否在多维电流特征空间中形成稳定、可重复识别的模式。

更有意思的问题：遇到训练集中没见过的分子怎么办？

任何依赖数据库的识别方法都会遇到一个问题：真实生物样本中的分子数量远远超过训练集。

如果模型只能回答“这个分子是不是我以前见过的标准品”，它的应用范围仍然有限。

研究因此加入了少样本学习（few-shot learning, FSL）。

研究人员发现，氨基酸、NMP、糖和肽产生的事件，在整体形态上分别呈现出相对稳定的类别特征。于是，他们不再要求模型首先判断“具体是哪一种分子”，而是先判断：它属于哪一类分子？

随后，他们拿出4种没有进入训练数据库的分析物进行测试：茶氨酸（theanine）、IMP、D-木糖（D-xylose）和三肽Asn-Met-Arg。

模型能够将这些陌生分析物分别归入氨基酸、NMP、糖和肽的大类。

一个需要特别区分的概念

少样本学习在这里实现的首先是类别识别，而不是仅凭一次检测就确定所有未知分子的精确化学身份。要进一步知道“这个NMP究竟是什么”，仍需要更具体的特征比较或标准品确认。

这也让后面的真实样本实验更值得关注。

离开标准品之后，酵母提取物给了它一次压力测试

标准溶液中的几十种分子可以被区分，并不等于复杂生物样本也能处理。

研究人员于是选择酵母细胞提取物（yeast cell extract）。其中同时含有氨基酸、肽、核苷酸、糖等多种成分。

经过3 kDa超滤等预处理后，样本进入MspA-FPBA。少样本学习首先将事件分成氨基酸、NMP、糖和肽四大类，然后已有的分类模型继续识别具体氨基酸和NMP。

在连续20分钟的记录中，可以清晰识别出Glu、Ser、Val、Phe、Tyr、Asn和Arg等7个氨基酸事件簇，同时还检测到了Met、His、Gln、Ala、Thr和Trp。

NMP方面除了AMP、UMP、CMP和GMP之外，还出现了一个未知事件簇。

模型首先判断它属于NMP；研究人员进一步与IMP标准事件比较，最终将其确认为什么？——肌苷酸（inosine monophosphate, IMP）。

先判断未知信号属于哪个分子大类，再逐步缩小身份范围。

当纳米孔遇到糖肽，它开始进入更复杂的多组学问题

蛋白质与糖之间并不是彼此独立的。

糖基化（glycosylation）就是典型例子。一个糖蛋白或糖肽同时包含肽链和糖链信息，而这也是多组学交叉分析最困难的区域之一。

研究人员首先用人工合成的糖基化七肽验证这一思路。经过亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase, LAP）水解后，纳米孔不仅识别出了Gly、Met、Gln和Arg等氨基酸，还检测到了来自糖基化片段的特殊事件。

随后，他们进一步分析了来源于蛋黄的天然 G2糖肽（G2 glycopeptide）。

样品经酸水解、LAP消化和超滤后进入纳米孔。系统识别出了Lys、Ala、Asn、Thr和Val等氨基酸以及GlcNAc，并将额外的糖类事件进一步归属为半乳糖（galactose, Gal）和甘露糖（mannose, Man）。定量结果与参考值总体保持较高一致性。

这一步的重要性并不在于它已经取代质谱，而在于研究展示了一条新的技术路线：
先把复杂生物大分子拆解，再使用同一个纳米孔接口读取来自不同分子类别的信息。

最容易被误读的地方：这还不是“一台纳米孔完成所有组学测序”

看到“同时识别氨基酸、核苷酸、糖和肽”，很容易进一步推导成“蛋白质、RNA和糖链终于可以用同一个纳米孔直接测序”。

该研究目前支持的结论还没有走到这一步。

首先，主要实验对象仍然是游离氨基酸、NMP、单糖和短肽；复杂糖肽需要先进行酸水解或酶解。完整蛋白质、完整RNA以及完整糖链的连续序列读取，并没有在这项研究中实现。

其次，98.7%不能简单理解成未来真实临床样本的检测准确率。它主要反映研究建立的数据集和实验条件下的事件分类表现。论文统计部分也明确指出，大部分结果来自3次独立实验；研究没有通过统计方法预先确定样本量，实验没有随机化，研究人员在实验及结果评估过程中也没有采用盲法。

未来如果要证明平台具有更广泛的应用能力，还需要跨批次、跨孔、跨设备、复杂样本以及更多未知分析物的系统验证。

换句话说，这是一项很有潜力的平台级概念验证（proof of concept），而不是已经成熟的通用多组学测序仪。

这项工作的价值，可能不只是多识别了几种分子

过去的纳米孔研究往往是“一个孔对应一类分析物”：有的擅长氨基酸，有的识别核苷酸，有的针对糖。

这项研究改变的是这个设计思路。

通过在MspA限制区域引入一个能够进行多种可逆化学反应的FPBA适配器，研究人员尝试把不同分子的识别转化成一种共同的问题：它与同一个纳米孔发生作用时，会产生什么样的电流特征？

如果未来能够将蛋白酶（protease）、核糖核酸酶（ribonuclease）和糖苷酶（glycosidase）等水解系统稳定地整合在纳米孔上游，那么理论上可以把蛋白质、RNA和糖链依次拆解成单体，再让同一种传感器完成识别。论文也把这一方向作为下一阶段设想。

届时，多组学检测的一个核心问题可能会发生变化：

我们不一定需要为每一种生命分子重新设计一整套仪器，
而可以尝试寻找一种足够通用的分子识别接口。

从目前的40种分析物，到复杂蛋白质、RNA和糖链之间，还有很长距离。但这项工作的启发在于，它让“一个传感器读取多种生命分子”从概念开始进入可以被实验检验的技术路线。

而对于纳米孔技术来说，这或许比单纯把分类准确率从98%提高到99%更值得关注。

参考文献

Yao L, Wang Z, Chen J, Sun W, Wang K, Xiao Y, Zhang H, Li W, Wang Y, Zhao L, Dai X, Qian L, Zhang P, Huang S. An engineered nanopore identifies saccharides, amino acids, peptides and ribonucleotides. Nat Biotechnol. 2026 Sep 14. doi: 10.1038/s41587-026-03308-9. Epub ahead of print. PMID: 42736414.