《食品科学》：西北农林科技大学颉向红副教授等：单宁酸与海藻糖复合冷冻保护剂对葡萄酒植物乳植杆菌低温保存性能的影响

植物乳植杆菌（Lactiplantibacillusplantarum）为杆状细菌，可在高pH值葡萄酒中高效完成苹果酸-乳酸发酵（MLF），将酒液中刺激感较强的苹果酸转化为更为柔和圆润的乳酸。这一转化不仅降低了葡萄酒的酸锐感，还对其多项指标产生积极影响，包括优化酒体的理化性质，提升其抵御有害微生物的能力，并改善其风味、口感等感官品质。植物乳植杆菌可作为在MLF较为常用的主要乳酸菌-酒酒球菌（Oenococcusoeni）的替代选择，与酒酒球菌相比，其启动MLF的效率更高，可显著缩短发酵周期，且其富含的多种风味相关酶系，能有效优化葡萄酒的香气轮廓，提升葡萄酒的感官品质。这一特性使植物乳植杆菌成为极具潜力的苹果酸乳酸发酵剂候选菌株，同时可降低乙酸过量积累带来的风险，而乙酸是葡萄酒挥发性酸的主要成分。

低温冻结广泛存在于自然环境中，在人类生产生活中具有重要作用。目前，低温保存在食品科学与低温生物学领域的诸多应用中，已成为一种高效处理方法。当前菌种常用超低温冷冻（－80 ℃）、液氮冷冻（－196 ℃）及冷冻干燥等保存方式，主流保护剂包括甘油、二甲亚砜（DMSO）等传统化学类与海藻糖（Tre）、脱脂乳、天然深共熔溶剂等天然类。然而，随着研究深入，低温保存的弊端与局限性逐渐显现，冷冻过程中产生的冰晶可能刺破细胞，进而影响细胞存活率或产品品质。同时，用于食品菌种冷冻保护领域中的主流冷冻保护剂-甘油以及其他类型传统低温保护剂虽可通过增强细胞膜渗透性改善低温保存效果，但冷冻效果并不理想且均具有细胞毒性，在高浓度下会对细胞膜结构造成破坏，过量摄入会导致细胞膜磷脂双分子层结构紊乱，破坏膜的完整性与流动性，进而引发细胞内物质外泄、代谢紊乱，最终导致细胞死亡；且部分成分无法被细胞完全代谢，残留后会抑制关键酶活性。此外，这类保护剂还可能会引发潜在的食品安全风险，一方面，用于工业生产的部分保护剂（如高纯度DMSO）并非食品级原料，若在菌种保藏后未完全去除，残留于食品产品中可能对人体健康造成潜在危害；另一方面，部分传统保护剂的降解产物可能与食品中的其他成分发生反应，产生有害物质，进一步加剧食品安全风险。为解决上述问题，研究人员将目光转向天然生物，但这些物质的提取纯化过程复杂，需持续探索更高效便捷的低温保护剂。因此，开发新型低温保存方法以实现绿色环保、高效无毒的冷冻保护非常必要。

冷冻阶段，细胞内外的水分会形成冰晶，其造成的机械损伤会加速氧化速率，促进自由基及醛、酮等次级代谢产物生成。因此，低温保存中提高细胞存活率的关键步骤是实现玻璃化，通过添加适宜的抗冻物质限制冰晶形成、避免结晶损伤。目前已应用的冷冻保护剂种类繁多，如蔗糖、Tre、脱脂乳、山梨糖醇及氨基酸等。其中Tre作为非还原性糖被广泛应用于细胞外低温保护剂。研究人员发现锯蝇幼虫体内含有高浓度Tre，使其能耐受低至－40 ℃的温度，因此推测Tre可能参与冷冻过程中的生命维持。此外研究表明，Tre的保护作用源于其双分子结构可形成氢键，在低温保存期间构建稳定的玻璃态基质，这不仅能防止功能分子因缺水受损，还可保护细胞膜免受冰晶结晶损伤。当使用Tre冷冻保存菌种时，其非渗透性、生物相容性化合物（如多种糖类和聚合物）在低温条件下可提升保存效果。但单一类型保护剂难以使菌体达到理想存活率，难以显著维持冷冻保存过程中的细胞活性，同时冷冻保护剂中的某些物质可被植物乳植杆菌代谢，并产生乙酸离子最终扩散穿过细胞膜，影响关键酶的活性。考虑到单宁酸（TA）作为一种葡萄等可食用果实中含量丰富的天然衍生多酚类物质，因其固有的生物降解性、抗氧化、无毒副作用及抗菌特性已被开发利用，也可与其他聚合物之间形成相互作用，如氢键、离子键及疏水作用。TA在微生物保护剂领域已有明确研究与应用。Cecconi等以葡萄酒源植物乳植杆菌VP08为对象的研究发现TA可调控菌株糖酵解、蛋白折叠等关键通路蛋白表达，延缓生长并显著延长胁迫环境下的存活时间，为其抗逆保护提供了分子依据；Zhang Haoxuan等则将TA与Fe(III)构建金属-酚醛网络，在植物乳植杆菌表面形成保护薄膜，有效提升菌株－20 ℃低温贮存的存活稳定性，其酚羟基能够清除活性氧，进而缓解菌体氧化损伤，直接证实了TA在微生物低温保护过程中的作用。因此，TA可通过多重途径保护植物乳植杆菌，为其与Tre复配制备绿色复合冷冻保护剂奠定了研究基础。

TA-Tre二者制备的冷冻保护剂，作为可持续开发的新型绿色溶剂由氢键供体和氢键受体组合形成，具有极低毒性和良好的生物降解性。因此，西北农林科技大学葡萄酒学院的麻俐彬、高子涵、颉向红*等以TA和Tre为原料制备绿色复合保护剂，进一步探究其对冷冻保存的葡萄酒植物乳植杆菌存活率的影响，探讨绿色复合保护剂的特性及其潜在保护机制。以期为绿色复合保护剂作为新型抗冻剂应用于植物乳植杆菌乃至不同菌种的抗冻保护提供理论支撑。

1 绿色复合保护剂的表观特征

1.1 绿色复合保护剂的制备与贮存

TA与Tre作为天然生物活性物质，在适当物质的量比条件下经加热搅拌混合，可形成稳定的复合冷冻保护体系。有研究表明，多酚类抗冻剂的抗氧化性与糖类抗冻剂的抑制水分迁移特性以及具有玻璃化或降低水体结晶温度的能力，可增强生物抗冻能力，减少低温导致的细胞损伤，这为细胞的冷冻保存提供了新的研究思路。本实验选择TA与Tre作为体系组分，构建绿色复合冷冻保护剂。

在绿色复合保护剂制备完成后，首先对其透明度进行测定（图2a），并初步判定绿色复合保护剂已制备成功。其中，TA∶Tre（1∶1）、TA∶Tre（1∶2）组和TA∶Tre（1∶3）组呈浅黄褐色透明液体，且随着Tre的增加色泽逐渐加深；TA∶Tre（2∶1）组和TA∶Tre（3∶1）组呈琥珀色透明液体，且随着TA的增加色泽显著加深。如图2b所示，由TA与Tre组成的复合保护剂在TA∶Tre（1∶1）、TA∶Tre（1∶2）、TA∶Tre（1∶3）、TA∶Tre（2∶1）组以及TA∶Tre（3∶1）组中均形成透明、均质且可流动的液体。同时所有配比在60 d内均保持液态，具有良好的流体稳定性。为精准对比不同物质的量比保护剂的流动性差异，后续系统分析流变学特性，以客观评价物质的量比对保护剂流动特性的影响。

1.2 绿色复合保护剂贮存后褐变程度分析

图3呈现了贮存60 d后TA∶Tre（1∶1）、TA∶Tre（1∶2）、TA∶Tre（1∶3）、TA∶Tre（2∶1）以及TA∶Tre（3∶1）的420 nm波长处吸光度（A420），其中TA∶Tre（3∶1）组的吸光度最大，而TA∶Tre（1∶1）、TA∶Tre（1∶2）和TA∶Tre（1∶3）组吸光度较小。由于TA∶Tre（2∶1）和TA∶Tre（3∶1）组相比于TA∶Tre（1∶1）、TA∶Tre（1∶2）和TA∶Tre（1∶3）组发生褐变程度更大，因此推测其内部生成了更多的褐变产物。根据已有研究发现，褐变主要原因是TA参与的非酶褐变反应，该褐变反应的产物可能属于美拉德反应产物，导致冷冻保护剂发生褐变，体系颜色逐渐加深。Tre作为非还原性二糖不参与褐变，本身不参与美拉德反应，但在一定条件下会水解生成葡萄糖，进而促进褐变反应的发生。

2 绿色复合保护剂的表征与结构特点

2.1 流变特性

剪切速率-剪切应力曲线（图4a）显示所有配比的剪切应力均随剪切速率的增大而上升，所有配比的冷冻保护剂均呈现非牛顿流体特性。同时从剪切速率-黏度曲线（图4b）可以看出，所有配比均呈现剪切稀化特性（非牛顿流体行为）。当剪切速率高于1.5 s－1时，所有冷冻保护剂的黏度随剪切速率增加而快速下降，后趋于稳定，进一步证实了其非牛顿流体特征。

2.2 绿色复合保护剂的傅里叶变换红外光谱分析

如图5所示，图谱中清晰显示了TA与TA-Tre的特征官能团，例如TA的羧基C＝O伸缩振动峰（1 651.61、1 702.56 cm－1）、酚羟基C—O伸缩振动峰（1 202.79、1 323.95 cm－1）；在TA-Tre中分别位移至1 630.96、1 691.54 cm－1以及1 211.05、1 242.72 cm－1；同时，Tre的碳氢键C—H伸缩振动峰（2 915.32 cm－1）在TA-Tre中位移至2 217.46 cm－1处。碳氢键的位移及峰形宽化，表明TA与Tre之间已形成稳定的网络结构，TA-Tre体系已成功构建。

2.3 绿色复合保护剂低温热力学特性分析

为确定TA-Tre复合体系的熔融/结晶行为及玻璃化转变特性，基于其热力学特征，采用差示扫描量热法主要对TA-Tre复合体系在－80～25 ℃区间的低温热行为进行研究。差示扫描量热流曲线表明，TA-Tre复合体系和甘油体系热行为特征相似，二者在降温过程中均未出现结晶现象，而是呈现出典型的玻璃态转变特性。玻璃态转变温度（Tg）作为非晶态物质的属性，是其区别于晶态物质的重要热学特征之一，TA-Tre复合体系和甘油体系的Tg分别为－63.321 19 ℃和－63.470 19 ℃（图6）。TA-Tre复合体系与甘油体系的玻璃化转变温度非常接近，说明二者在低温下的玻璃态转变特性（从玻璃态向高弹态转变的温度）差异极小，低温环境下的玻璃态稳定性相近，并且TA-Tre复合体系在从高温向低温过渡的多数温度区间中均能维持液体状态。

此外，在－80～25 ℃区间内，TA-Tre复合体系与甘油体系均未出现明确的熔点。该现象源于TA-Tre复合体系与甘油体系在低温下呈无定形玻璃态，室温下转变为溶液态。根据Knorr等的研究现象，将其描述为玻璃化转变特征的结果，并将其归类为无定形TA-Tre复合体系。

3 绿色复合保护剂在植物乳植杆菌低温保存中的保护效果

3.1 LPXJ-25的生长曲线

对LPXJ-25的生长情况进行表征，图7表明，LPXJ-25的生长曲线呈现典型的S型生长曲线，LPXJ-25大约从 6 h进入对数生长期，18 h左右进入稳定期。

3.2 绿色复合保护剂对LPXJ-25冻存稳定性的影响

为探究不同物质的量配比（TA∶Tre）复合体系对LPXJ-25的保护作用效果，通过点板法测定不同冻存时间的LPXJ-25菌落生长情况。从图8可以看出，0 d时所有组别在对应稀释倍数下的菌落数量无明显差异。经过30 d冻存后，各组别菌落数量呈现明显分化，冻存稳定性差异明显。其中，对照组（添加甘油）的菌落数量大幅减少，细胞存活率显著下降；而TA∶Tre（1∶1）、TA∶Tre（1∶2）、TA∶Tre（1∶3）、TA∶Tre（2∶1）以及TA∶Tre（3∶1）5 组均表现出不同程度的保护效果，菌落数量较对照组多。冻存稳定性最为突出的是TA∶Tre（1∶1）组，在103、104等稀释倍数下，菌落密度明显高于其他组，菌落分布更为密集，说明该配比下的复合体系对LPXJ-25的保护作用最为显著，能够有效减轻贮存过程中的菌体损伤，维持更高的活菌数量，有效控制冻存过程中活菌数量的减少。其余物质的量配比（1∶2、1∶3、2∶1、3∶1）处理组的菌落数量介于对照组与TA∶Tre（1∶1）组之间，保护效果相对较弱，未呈现出更优的稳定性提升作用。在1∶1比例条件下，两者处于作用平衡状态，既避免了TA过量导致的蛋白过度交联，也防止了Tre过量引发的渗透压失衡，最大化发挥了物理阻隔与氧化防护的双重作用。综上所述，选用TA∶Tre（1∶1）作为最优冷冻保护剂进行后续实验。

3.3 LPXJ-25细胞存活率

为验证TA∶Tre（1∶1）复合冷冻保护剂的保护效力，本研究采用平板菌落计数法检测LPXJ-25复苏后的存活率。如图9所示，使用该复合保护剂的实验组细胞存活率达76.67%，显著高于甘油对照组（34%， P＜0.001）。同时单一Tre和TA组的菌落数量介于两者之间，这表明TA∶Tre（1∶1）复合保护剂能有效减轻冷冻过程对细胞造成的损伤，其保护效果优于传统甘油，展现出作为绿色新型冷冻保护剂的应用潜力。

3.4 复苏LPXJ-25的增殖活力

为评估不同冷冻保护剂对菌株冻后生长复苏能力的影响，测定了各组菌株在24 h培养周期内的A600生长曲线（图10）。从整体趋势来看，4 组菌株均呈现典型的细菌生长规律，在0～4 h处于生长延滞期，4～18 h进入对数生长期，菌液浓度显著提升，18 h后逐步进入稳定期。在整个生长过程中，TA∶Tre（1∶1）复合冷冻保护剂处理的菌株生长速率明显高于单一Tre组、单一TA组及传统甘油保护剂组，表现出更强的复苏与增殖能力；单一Tre组与TA组的生长曲线较为接近，整体表现优于甘油组，但均不及复合保护剂组。这表明，单一Tre虽具备优良的抗冻特性，但其保护效果有限，而TA与Tre复配后形成的复合体系，通过形成独特的超分子网络结构实现了保护效果的协同提升。

3.5 复苏LPXJ-25细胞产酸能力

产酸能力是植物乳植杆菌参与葡萄酒MLF的核心功能特性，其冻后产酸活性的高低直接反映菌株低温保存后的功能完整性与实际应用价值，也是评价冷冻保护剂保护效果的重要指标。为进一步验证不同冷冻保护剂对菌株冻后功能活性的影响，测定了甘油对照组、TA∶Tre（1∶1）复合组及相同浓度单一TA、单一Tre组菌株在24 h培养周期内的产酸能力（图11）。结果显示，所有组别均随培养时间延长呈现pH值逐渐降低的趋势，表明菌株冻后均具有产酸能力，但不同组别间的产酸速率与降酸幅度存在明显差异。TA∶Tre（1∶1）复合组在培养6 h后即呈现快速降酸趋势，24 h时pH值降至最低，显著低于单一Tre组、单一TA组及甘油对照组；单一Tre组降酸速率略高于单一TA组，但pH值均显著高于复合组，且冻后菌株产酸启动时间较复合组延迟2～4 h。产酸能力作为植物乳植杆菌的核心功能指标，其差异直接反映菌株冻后活性的完整性，该结果进一步证实，TA-Tre复合体系对菌株的保护效果显著优于单一组分，单一Tre虽能在一定程度上维持菌株活性，但其无法实现对菌株功能的完整保护，而复合体系通过独特的超分子网络结构，实现了对菌株冻后活性与功能的保护。

4 结 论

本研究以TA和Tre为天然原料，通过混合加热搅拌法制备绿色复合冷冻保护剂。对不同物质的量配比的冷冻保护剂的理化性质以及贮存稳定性进行分析，筛选出最优配比并考察其对LPXJ-25的低温保护效果。差示扫描量热分析表明，复合保护剂具备良好的低温玻璃化稳定能力，可有效抑制冷冻过程中冰晶形成。冻存稳定性实验证实，TA∶Tre（1∶1）为最优配比，该绿色复合保护剂具有最佳性能。其既能在贮存期内保持良好流体稳定性并降低非酶褐变，又能维持高水平的氢键网络结构及抗冻性能，可显著提高细胞冷冻存活率，最高可达76.67%。生长曲线与产酸能力测定显示，复合保护剂处理组菌株冻后复苏增殖速率更快，24 h内pH值降幅更大，充分证明其不仅能维持菌株存活，更能完整保留其核心功能活性。本研究证实了绿色复合保护剂所得结果可为其他食品微生物低温保存提供一种有效策略。

作者简介

通信作者：

颉向红，西北农林科技大学葡萄酒学院副教授，硕士生导师。2023年博士毕业于西北农林科技大学食品学院，同年7月进入西北农林科技大学葡萄酒学院从事博士后工作，2025年7月留校任教于葡萄酒学院，从事微生物资源挖掘、制剂关键技术研发及农产品保鲜加工研究工作。主持/参与国家级/省部级项目9 项，入选 “国家资助博士后研究人员计划(B档)”，以第一作者、通信发表中英文期刊发表论文11 篇，获省部级以上荣誉3 项。

第一作者：

麻俐彬，女，西北农林科技大学葡萄酒学院葡萄与葡萄酒工程（卓越工程师班）本科生。研究方向为酿酒微生物及葡萄保鲜加工。参与申请计算机软件著作权1 项，参与发表SCI学术论文2 篇。

引文格式：

麻俐彬, 高子涵, 翟一闻, 等. 单宁酸与海藻糖复合冷冻保护剂对葡萄酒植物乳植杆菌低温保存性能的影响. 食品科学, 2026, 47(14): 309-316. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251231-280.

MA Libin, GAO Zihan, ZHAI Yiwen, et al. Effect of a tannic acid and trehalose composite cryoprotectant on the cryopreservation of Lactiplantibacillus plantarum isolated from wine. Food Science, 2026, 47(14): 309-316. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251231-280.

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实习编辑：陈师昀；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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